于瑤 殷宗琦 李丹 周廣東 曹誼林 劉豫

軟骨缺損在臨床上較為常見，因軟骨自我修復(fù)與再生能力低，自體軟骨供體有限，使軟骨缺損修復(fù)極為困難[1]。組織工程技術(shù)為從根本上解決組織、器官缺損的治療提供了新的希望[2]，但組織構(gòu)建過程所采用的支架材料極易在皮下等免疫機能活躍的移植部位引發(fā)炎癥反應(yīng)，干擾軟骨再生。

我們的前期研究已建立了基于自體軟骨細胞的組織工程軟骨膜片和可注射軟骨再生技術(shù)。該技術(shù)不依賴任何支架材料，不存在支架材料引起的免疫排斥反應(yīng)，僅需極少量種子細胞，即可在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成新生軟骨膜片[3]，可用于修復(fù)氣管損傷、耳再造或全鼻再造等[4]。此外，將新生的軟骨膜片進行顆?；庸ず笾瞥绍浌莿驖{，可用于微創(chuàng)注射隆鼻或改善面部凹陷畸形[5]。但該技術(shù)采用的自體細胞來源有限，獲得方式有創(chuàng)，且軟骨細胞反復(fù)傳代易老化，其形態(tài)、活性、表型會發(fā)生變化，部分功能將喪失。因此，對剩余種子細胞的儲存就顯得極為重要。

目前，深低溫冷凍保存是應(yīng)用于各類細胞長期儲存最普遍的方式。本研究利用深低溫冷凍保存技術(shù)，將獲得的人耳軟骨細胞進行1個月的儲存，并在復(fù)蘇后對細胞進行擴增、傳代及體內(nèi)外軟骨再生等一系列實驗，研究凍存對人耳軟骨細胞的細胞活力、增殖和體外/體內(nèi)軟骨再生能力的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通健康裸鼠 （上海甲干生物科技有限公司），4～6周齡，雌雄不限，用于可注射軟骨體內(nèi)植入評價。實驗嚴格依照實驗動物保護指南的要求進行。

1.2 實驗器材與試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素 B（Hyclone公司，美國），膠原酶（Sigma公司，美國）、0.25%胰蛋白酶（Gibco 公司，美國），bFGF（R&D 公司，美國），CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒（Sigma公司，美國），Ⅱ型膠原定量試劑盒（Sigma公司，美國），酶標儀 （Multiskan Ascent V1.22,354-00187T，Instrument Type 公司，美國），全波長酶標儀（Thermo Fisher公司，美國），程序降溫儀（Thermo Fisher公司，美國）。

1.3 實驗分組及設(shè)計

軟骨種子細胞的獲取過程都存在一定的創(chuàng)傷性，為避免再次獲取種子細胞造成的創(chuàng)傷、反復(fù)傳代對細胞的影響以及種子細胞的浪費，本研究將原代軟骨細胞培養(yǎng)并擴增至第1代 （P1），然后分成2組：將收集的P1代軟骨細胞用FBS重懸后加入含10%DMSO的FBS混合液，經(jīng)程序降溫后儲存至液氮中，1個月后復(fù)蘇，隨后進行擴增、傳代與種膜，設(shè)為實驗組（Exp組）；細胞不經(jīng)凍存并繼續(xù)擴增和傳代至第3代（P3），按相同密度接種生成軟骨膜片，設(shè)為對照組（Ctrl組）。評估兩組體外軟骨膜片的濕重、體積及形成質(zhì)量。將兩組軟骨膜片分別顆?；笞⑸渲谅闶笃は?，體內(nèi)培養(yǎng)8周后評估體內(nèi)再生軟骨的濕重、體積、軟骨得率及形成質(zhì)量等。

1.4 人耳軟骨細胞的獲取和培養(yǎng)

實驗中應(yīng)用的臨床樣本均來源于小耳畸形患者術(shù)中廢棄的殘耳軟骨，均獲患者知情同意。

將殘耳軟骨塊剪成1 mm3碎塊，加入0.15%膠原酶，震蕩消化8～12 h，過濾，收集，去上清液，高糖DMEM重懸，按照0.5×106個/皿的密度接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。每3天換液一次，待軟骨細胞生長至75%～80%融合時傳代[6-7]。

1.5 細胞凍存與復(fù)蘇

收集細胞，F(xiàn)BS制備細胞懸液。配制冷凍保存溶液（使用前配制）：在離心管中加入含10%DMSO的FBS混合液，制成凍存液。取與細胞懸液等量的凍存液，加入細胞懸液中，制成細胞凍存懸液，最后DMSO的濃度為 5%～10%，細胞濃度為（1～5）×106cells/mL，分裝于冷凍保存管中，1～2 mL/vial。放入程序降溫儀中，按預(yù)先設(shè)定的程序執(zhí)行，溫度達到-80℃以下時，轉(zhuǎn)入液氮中保存。復(fù)蘇時用37℃溫水快速晃動解凍，加入培養(yǎng)液后按0.5×106個/皿的密度接種到新培養(yǎng)皿中，隔天換液。

1.6 繪制細胞生長曲線

用CCK-8試劑盒測P3及復(fù)蘇后P3細胞的第1、3、5、7、9 天的 OD 值，繪制成細胞生長曲線。

1.7 構(gòu)建體外軟骨膜片

將人殘耳軟骨細胞收集后，用常規(guī)DMEM細胞培養(yǎng)液重懸，按2.0×106個/孔的濃度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d后改用無血清軟骨重分化培養(yǎng)液，每天換液，培養(yǎng)2周[8]。

1.8 軟骨膜片體外觀察、濕重體積測定及顆?；?/h3>

棄培養(yǎng)液，PBS清洗3遍，用鑷子將膜片與6孔板分離，用紗布盡量粘掉膜片表面的液體，稱量并記錄單個膜片的濕重，用排水法測得單個膜片體積。將膜片剪至漿狀后PBS清洗并離心3遍（1 800 r/mim，5 min），棄PBS，將漿狀軟骨膜片分裝至1 mL螺旋口注射器內(nèi)。全程均為無菌操作。

1.9 體內(nèi)再生軟骨大體觀察、濕重體積及軟骨得率測定

注射后 8周取材，剝離表面的包膜，進行大體觀察及濕重、體積及軟骨得率的測量。

1.10 組織學染色

將標本固定于4%多聚甲醛 24 h，脫水、石蠟包埋，切片（厚度為 5 μm），進行蘇木素-伊紅染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細胞外基質(zhì)分泌情況。

1.11 生化成分定量檢測

采用Alcian Blue法檢測再生軟骨組織中的GAG含量，首先根據(jù)標準品濃度梯度繪制標準曲線，按照酶標儀比色結(jié)果（波長520 nm）與標準曲線計算樣本GAG含量。以樣本堿水解法檢測再生軟骨的總膠原含量，根據(jù)酶標儀比色結(jié)果（波長550 nm）與計算公式得到樣本中總膠原的含量。采用hoechst 33258染色法進行DNA定量檢測，根據(jù)DNA標準品濃度梯度繪制標準曲線后，按照酶標儀檢測結(jié)果（激發(fā)光為480 nm，發(fā)射光為520 nm）與標準曲線，計算樣本中DNA含量。

1.12 統(tǒng)計學分析

分析體內(nèi)外再生軟骨的濕重、體積、生物化學定量檢測結(jié)果及體內(nèi)再生軟骨的軟骨得率等定量指標，以（x±s）表示，SPSS 17.0 軟件進行單樣本 t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組軟骨細胞形態(tài)、活性、功能

光鏡下兩組軟骨細胞的大小、形態(tài)均無明顯變化，未出現(xiàn)增大、鋪展、老化、去分化等，傳代擴增到第3代時，細胞大小及形態(tài)均無明顯變化，2～3 d達80%～90%融合。復(fù)蘇后擴增至第3代時依然呈現(xiàn)良好的形態(tài)特征。活/死染色、HE及阿利新藍染色可觀察到兩組軟骨細胞完全伸展后呈三角形或多角形，且細胞可正常分泌ECM（圖1）。

2.2 細胞增殖曲線

通過生長曲線可觀察到第3天時兩組軟骨細胞增殖能力均明顯增強，第7天開始細胞增殖變慢。增殖曲線符合細胞生長規(guī)律，并顯示Ctrl組與Exp組細胞增殖情況無明顯差異（圖2）。

2.3 細胞經(jīng)程控降溫儀程序降溫

本實驗中降溫速度為-0.01～-60℃/min，溫控精確度達到了0.01℃/min，溫度達到-80℃以下時，轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。有效控制了DMSO在4℃以上與細胞接觸的時間。

2.4 體外軟骨膜片及顆?；浌?/h3>

兩組軟骨細胞均按照相同密度接種，經(jīng)體外培養(yǎng)2周后，均形成了瓷白色、表面光滑且具有一定厚度及力學強度的軟骨膜片（膜片有一定的韌性、鑷子正常操作過程中無斷裂、破碎等現(xiàn)象）；用無菌剪刀將體外軟骨膜片剪碎成漿狀，分裝至1 mL螺口注射器中（圖 3）。

2.5 體內(nèi)再生軟骨組織大體及組織學觀察

兩組可注射軟骨注射至裸鼠皮下即刻，均有一定程度的水腫樣表現(xiàn)，8周時均有一定程度的吸收；8周后取材，兩組顆粒化軟骨均可在體內(nèi)形成軟骨樣組織塊，Ctrl組形成的軟骨樣組織顏色為白色，表面較光滑，具有一定的力學強度；Exp組表面光滑，顏色、質(zhì)地與Ctrl組相比較無明顯差異，但體積略小；兩組軟骨樣組織均有一定的硬度和彈性。HE染色可見體內(nèi)再生軟骨樣組織中軟骨塊并不是連續(xù)的，而是呈島狀分布，兩組軟骨樣組織均形成軟骨陷窩，陷窩間有藍染的胞外基質(zhì)成分，形態(tài)成熟，Ctrl組軟骨塊分布較稀疏，Exp組較為緊密（圖4）。

2.6 體外再生軟骨濕重及體積

體外培養(yǎng)2周時，Ctrl組及Exp組的體外膜片的濕重分別為（0.42±0.04） g和（0.38±0.45） g；體積為（0.33±0.03） mL 和（0.34±0.04） mL。 統(tǒng)計結(jié)果表明，Ctrl組膜片濕重與Exp組之間具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；Ctrl組膜片體積與 Exp 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.7 體內(nèi)再生軟骨濕重、體積及軟骨得率

體內(nèi)培養(yǎng)8周，Ctrl組及Exp組體內(nèi)再生軟骨的濕重分別為（0.17±0.005） g 和（0.18±0.005） g；體積為（0.21±0.02） mL 和（0.11±0.013） mL；軟骨得率為（42±4.00）%和（41.2±2.68）%。 Ctrl組體內(nèi)再生軟骨的濕重與Exp組比較，差異明顯（P＜0.05）；兩組體內(nèi)再生軟骨的體積和再生軟骨的得率均無明顯差異（P＞0.05）。由此可知，凍存對體內(nèi)軟骨的再生無明顯影響。

2.8 體內(nèi)外再生軟骨的DNA、總膠原及GAG定量檢測

體外培養(yǎng)2周后，Ctrl組與Exp組的DNA含量分別為（4.41±0.17）ng/mg 和（4.20±0.07） ng/mg；總膠原含量為（0.39±0.004） μg/mg和（0.35±0.01） μg/mg；GAG 含量為（10.75±0.69） μg/mg和（10.19±0.46） μg/mg。兩組的DNA及GAG定量無顯著性差異 （P＞0.05）；Ctrl組總膠原定量與Exp組相比差異明顯（P＜0.05）。

體內(nèi)8周后，Ctrl組與Exp組的DNA含量分別為（16.17±0.34） ng/mg 和（15.86±0.07）ng/mg；總膠原含量為（0.34±0.08） μg/mg 和（0.492±0.08） μg/mg；GAG含量為（17.05±0.83） μg/mg和（16.22±1.09）μg/mg。兩組的DNA及GAG定量無顯著性差異 （P＞0.05）；Ctrl組總膠原定量與Exp組相比差異明顯 （P＜0.05）?？傮w觀察，體內(nèi)再生軟骨的DNA、總膠原、GAG含量整體高于體外再生軟骨。

圖1 兩組軟骨細胞的形態(tài)、活/死及組織學染色Fig.1 Morphological observation,live/dead and histological staining of chondrocytes in the 2 groups

圖2 兩組軟骨細胞的增殖曲線Fig.2 Growth curve of chondrocytes in the 2 groups

圖3 體外2周軟骨膜片F(xiàn)ig.3 Chondrocyte sheet after 2 weeks'culture in vitro

圖4 體內(nèi)培養(yǎng)8周再生軟骨的大體及組織學觀察Fig.4 Gross view and histological observation of regenerated cartilage after 8 weeks'culture in vitro

3 討論

組織工程技術(shù)為從根本上解決組織、器官缺損的治療提供了新的希望[9]。軟骨膜片由自體軟骨細胞及其分泌的細胞外基質(zhì)構(gòu)成，不依賴任何支架材料，不存在支架材料引起的免疫排斥反應(yīng)，已在軟骨再生領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[10-11]。軟骨膜片進行顆?；庸ず笾瞥绍浌莿驖{，可用于微創(chuàng)注射隆鼻或改善面部凹陷畸形[9]。但種子細胞的獲取依然是限制其發(fā)展的一個重要因素。

目前，低溫冷凍保存是應(yīng)用于各類細胞長期儲存的最普遍方式。凍存和復(fù)蘇的過程包括：程序降溫-低溫儲存-融凍-培養(yǎng)-傳代-接種，其中任一步驟的失敗都會影響細胞的活性，并導(dǎo)致細胞不可逆的損傷[12]。在方法得當、操作正規(guī)的基礎(chǔ)上，DMSO低溫凍存的人軟骨細胞復(fù)蘇后，其細胞形態(tài)與凍存前無明顯差異，增殖與分化能力可保持3～4代[13]。本實驗中，從光鏡、細胞爬片染色、增殖曲線來看，Ctrl組與Exp組細胞均可正常增殖，且具備良好的活力和基質(zhì)分泌功能。體外再生軟骨樣組織的大體及組織學染色觀察可見Ctrl組與Exp組細胞均形成大量軟骨陷窩，且有蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的表達，兩組DNA及總GAG定量均未表現(xiàn)出明顯差異。實驗組體外膜片濕重及總膠原定量略高于對照組，提示Exp組膜片含水量較高及所分泌的總膠原較高，總膠原的組成成分及兩組間的差異尚需更為深入的研究。

體內(nèi)培養(yǎng)8周后，兩組再生軟骨樣組織表面較光滑，顏色為白色；組織學染色可見兩組軟骨細胞均形成大量軟骨陷窩；軟骨得率都在40%左右；兩組DNA及總GAG定量均未表現(xiàn)出明顯差異；體內(nèi)再生軟骨的總膠原定量兩組有統(tǒng)計學差異，這可能是由于體內(nèi)再生軟骨樣組織中軟骨塊并非連續(xù)存在而是成島狀分布導(dǎo)致的。

通過濕重、體積、軟骨得率、組織學及生化成分定量檢測可觀察到，Ctrl組體內(nèi)外再生軟骨與Exp組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明凍存對軟骨細胞沒有明顯影響。

本實驗中，兩組軟骨細胞在體內(nèi)外均形成了正常的軟骨樣組織，說明凍存對體內(nèi)外軟骨再生能力無明顯影響。但本實驗凍存的時間僅1個月，更長期的凍存是否會對再生軟骨造成影響尚需進一步研究證實。

4 結(jié)論

經(jīng)凍存的軟骨細胞在形態(tài)、活力、增殖能力、軟骨特異的GAG分泌能力、體內(nèi)外軟骨形成能力等方面與未經(jīng)凍存的軟骨細胞相比沒有明顯差異。