郭黎姣，姜慧嬌，韓歡歡，楊雄峰，周 青，王小義，李林林2，廖振宇2，陳雪玲2，吳向未

包蟲病(hydatiddisease，HD)是由棘球絳蟲的幼蟲階段引起的一種嚴(yán)重威脅生命的人獸共患病[1]，包括泡狀棘球蚴病(Echinoccusmultilocularis)和細(xì)粒棘球蚴病(Echinococcusgranulosus)。泡狀棘球蚴病好發(fā)于肝臟，肝泡狀棘球蚴病又稱為肝泡型包蟲病(hepatic alveolar echinococcosis，HAE)，其具有腫瘤樣浸潤性生長和轉(zhuǎn)移的生物特性，損傷肝組織，嚴(yán)重者最終引起肝衰竭[2]。張示杰[3]研究發(fā)現(xiàn)，包蟲病與血管生成息息相關(guān)，肉眼觀察泡狀棘球蚴組織內(nèi)外部均有血管生成，可能是泡狀棘球蚴病浸潤、轉(zhuǎn)移等生物行為的重要環(huán)節(jié)之一。李佳琦[4]通過雙源能量成像碘定量技術(shù)對感染泡狀棘球蚴的肝臟進(jìn)行掃描，其結(jié)果顯示HAE組織內(nèi)缺乏血供或無血供，邊緣區(qū)血供明顯高于HAE組織及正常肝組織。血管內(nèi)皮生子因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor, VEGF)家族包括5個(gè)因子，特異性作用于損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移和歸巢，已被證明病理狀態(tài)下為惡性腫瘤的血管生成中起至關(guān)重要的作用[6]，其中VEGFA是血管生成的主要調(diào)控因子[5]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[7]，是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)的主要驅(qū)動因子，有助于在腫瘤細(xì)胞中建立自分泌信號通路，增加腫瘤侵襲性。

本研究在沙鼠肝泡狀棘球蚴病模型基礎(chǔ)上，通過檢測病灶組織中HIF-1α、VEGFA表達(dá)水平變化及病灶部位的MVD-CD34的表達(dá)，探討HIF-1α與VEGFA在病變中對病灶局部血管新生的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)動物選擇健康未育的成年雌性沙鼠126只，8～9周，體重(42±5)g，均購于新疆維吾爾族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心。泡狀棘球蚴頭節(jié)接種鼠為人工腹腔感染泡球蚴24周灰倉鼠1只。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 VEGFA、CD34單克隆抗體購于美國Abcam公司(ab52917、ab81289)；Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；基因引物使用Primer5.0軟件合成，由上海生工生物工程公司合成，β-actin(基因號：NM_007393.5)：上游引物ACTGCTCTGGCTAGCAC，下游引物ACATCTGCTGGAAGGTGGAC；HIF-1α：上游引物CTGCCACTGCCACCACAACTG，下游引物TGCCACTGTATGCTGATGCCTTAG；VEGFA：上游引物GTACCTCCACCATGCCAAGT，下游引物CTACCAGGGTCTCGATTGGA；熒光染料(SYBR Green Ⅰ)購于德國QIAGEN公司。

1.3沙鼠肝泡狀棘球蚴動物模型建立及分組 將126只雌性沙鼠隨機(jī)分成空白組(6只)、假手術(shù)組(60只)、模型組(60只)。將沙鼠麻醉后，碘伏消毒腹部，作劍突下正中切口0.5 cm，逐層開腹暴露肝臟，于肝左葉注射原頭節(jié)懸混液0.1 mL(原頭節(jié)提取方法參考文獻(xiàn)[8]，活原頭節(jié)約500個(gè))，假手術(shù)組則注射同體積PBS。沙鼠關(guān)腹后置于保溫箱恢復(fù)體溫，常規(guī)飼養(yǎng)，模型組、假手術(shù)組分別于術(shù)后第3 d、7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、70 d、84 d、98 d、112 d隨機(jī)取6只沙鼠，安樂死處死沙鼠。各組標(biāo)本均取新鮮病灶非切緣區(qū)組織，每塊標(biāo)本均包括包蟲組織、病灶邊緣區(qū)及正常肝組織待檢。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測組織中HIF-1α、VEGFA mRNA表達(dá)水平 各組采用Trizol提取組織總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用SYBR Green，Bio-Rad CFX Manager 3.1系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。PCR循環(huán)由95 ℃ 3 min初始變性，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s的40個(gè)循環(huán)組成。以β-actin作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化參照。采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平[9-10]。

1.5病理標(biāo)本制備及免疫組織化學(xué)檢測方法 標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，以4 μm層厚連續(xù)切片及HE染色。免疫組化SP法檢測組織中VEGFA、MVD-CD34，步驟根據(jù)試劑盒操作說明，DAB顯色，蘇木素核染，樹膠封片。

1.6原位雜交檢測HIF-1α mRNA表達(dá) 標(biāo)本用含有1%DEPC的4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水。原位雜交探針為地高辛標(biāo)記的寡核苷酸，雜交信號檢測為DAB顯色，具體步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行。陽性表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色染色，判定結(jié)果同免疫組化檢測判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.7免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 參考文獻(xiàn)[11]，采用作色強(qiáng)度和陽性百分比評分乘積作為最終評分。著色強(qiáng)度：不顯色或顯色不清為0分，淺棕色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；陽性細(xì)胞百分比：高倍鏡下隨機(jī)取3個(gè)陽性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均陽性細(xì)胞百分比，≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。MVD-CD34判斷標(biāo)準(zhǔn)：參考文獻(xiàn)[12]，被抗體染色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，無論是否呈管腔，均記為1個(gè)微血管，管徑>8個(gè)紅細(xì)胞直徑及匯管區(qū)血管排除在外。

2 結(jié) 果

2.1組織病理學(xué)特點(diǎn)及MVD-CD34結(jié)果 模型組沙鼠在感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后早期(感染后14 d內(nèi))，鏡下可見穿刺部位結(jié)節(jié)狀肉芽腫形成，結(jié)節(jié)內(nèi)有多個(gè)小囊泡，囊泡周圍為壞死組織，炎性細(xì)胞浸潤，結(jié)節(jié)內(nèi)MVD-CD34染色陽性，周圍正常肝組織紊亂，肝竇擴(kuò)張，大量紅細(xì)胞浸潤；病灶中期(感染后14～56 d)HAE病灶可見囊壁生發(fā)層和角質(zhì)層形成，角質(zhì)層外肝細(xì)胞間MVD-CD34呈高表達(dá)，偶可見炎性細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞浸潤的增殖區(qū)；病灶晚期(感染后56 d到終末期)HAE組織呈大小不等囊泡，囊泡周圍有明顯的纖維化帶，MVD-CD34低表達(dá)，正常肝組織血管擴(kuò)張明顯(見圖1、2)。假手術(shù)組肝細(xì)胞可見不同程度的氣球樣變；空白組呈正常的肝組織結(jié)構(gòu)。

注：分別為造模后3 d、7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、70 d、84 d、98 d、112 d圖1 沙鼠感染原頭節(jié)后不同時(shí)期的沙鼠肝臟組織HE染色(40×)Fig.1 HE staining of gerbil liver tissue at different stages after gerbil infection in the primordial section (40×)

注：空白組；假手術(shù)組；造模后3 d、7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、70 d、84 d、98 d、112 d圖2 不同時(shí)間沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)MVD-CD34染色(200×)Fig.2 MVD-CD34 staining of the marginal zone of the genital alveolar echinococcosis at different times (200×)

2.2HIF-1α、VEGFA mRNA表達(dá)水平 模型組沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)HIF-1αmRNA在術(shù)后隨著感染時(shí)間延長，其表達(dá)量呈先升高后下降再升高趨勢；術(shù)后14 d其表達(dá)量(4.653±1.397)，高于空白組(1.000±0.001)，低于假手術(shù)組(10.567±1.715)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.732，P<0.001)；術(shù)后42 d時(shí)，HIF-1α mRNA表達(dá)量最高(26.712±3.747)，顯著高于空白組(1.000±0.002)、假手術(shù)組(1.230±0.233)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.536,P<0.003)；模型組HIF-1α mRNA術(shù)后42 d后開始下降，術(shù)后84 d 再次升高，術(shù)后112 d HIF-1α相對表達(dá)量為(11.343±2.439)，均高于空白組(1.000±0.002)、假手術(shù)組(0.472±0.051)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.189,P<0.001)。模型組沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)VEGFA mRNA表達(dá)趨勢與HIF-1α mRNA表達(dá)趨勢相似，在術(shù)后14 d其表達(dá)量(0.305±0.034)低于空白組(1.00±0.001)、假手術(shù)組(1.648±0.141)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.174,P<0.01)；隨著感染時(shí)間延長，術(shù)后42 d時(shí)表達(dá)量最高(2.912±0.123)，與空白組(1.000±0.002)、假手術(shù)組(0.478±0.099)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.158,P<0.01)；術(shù)后112 d時(shí)其表達(dá)量(1.823±0.113)，均高于空白組(1.000±0.001)、假手術(shù)組(0.352±0.172)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.158,P<0.01)，見圖3。

2.3HIF-1α、VEGFA、MVD-CD34蛋白染色結(jié)果 HIF-1α原位雜交結(jié)果顯示，空白組、假手術(shù)組HIF-1α mRNA表達(dá)均為陰性，模型組術(shù)后第14 d HIF-1α mRNA主要表達(dá)在病灶炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞核中，邊緣區(qū)肝細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞呈陰性表達(dá)；術(shù)后第42、112 d HIF-1α mRNA主要在病灶邊緣區(qū)肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。隨著沙鼠感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)時(shí)間不同，HIF-1α表達(dá)程度不同，呈先升高后下降趨勢，術(shù)后第42 d表達(dá)最高，與空白組、假手術(shù)組及其他時(shí)間點(diǎn)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4，表1。

VEGFA免疫組化陽性表達(dá)部位以泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞胞漿及胞外。隨著沙鼠感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)時(shí)間點(diǎn)不同，VEGFA在邊緣區(qū)表達(dá)程度不同，呈先升高后下降趨勢，術(shù)后第42 d邊緣區(qū)VEGFA表達(dá)最高，與空白組、假手術(shù)組及及其他時(shí)間點(diǎn)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5，表1。

注：**P<0.01; ***P=0.001；A不同時(shí)間點(diǎn)各組HIF-1αmRNA表達(dá)水平；B不同時(shí)間點(diǎn)各組VEGFA mRNA表達(dá)水平。 圖3 不同時(shí)間點(diǎn)各組HIF-1α、VEGFA mRNA表達(dá)水平Fig.3 HIF-1α and VEGFA mRNA expression levels in each group at different time points

HIF-1αVEGFA14d42d112d14d42d112d空白組0002.000±0.6322.000±0.6322.000±0.632假手術(shù)組1.000±0.6320.833±0.7531.000±0.2521.000±0.6321.833±0.7532.167±0.753模型組6.667±0.0118.833±2.7141.833±0.7533.000±0.8947.667±1.3661.732±0.651F/χ28.6729.00015.69011.25070.0590.326P0.0030.0030.0000.0010.0000.727

圖4 沙鼠感染泡狀棘球蚴后不同時(shí)期HIF-1α mRNA表達(dá)(200×)Fig.4 HIF-1α mRNA expression in gerbils infected with Echinococcus granulosus (200×)

CD34免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，空白組、假手術(shù)組除匯管區(qū)、中央靜脈外無CD34陽性表達(dá)；模型組沙鼠在感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后第14 d CD34主要表達(dá)在纖維囊壁形成部位；第42 d外囊壁形成晚期囊壁形成后，外囊壁外側(cè)邊緣區(qū)肝細(xì)胞間CD34呈高表達(dá)，與空白組、假手術(shù)組及及其他時(shí)間點(diǎn)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6，表2。

圖5 沙鼠感染泡狀棘球蚴后不同時(shí)期VEGFA表達(dá)(200×)Fig.5 VEGFA expression in different periods after gerbils infected with Echinococcus granulosus (200×)

14d42d112d空白組0.333±0.5160.333±0.5160.333±0.516假手術(shù)組0.500±0.8370.167±0.4080.167±0.408模型組23.167±3.31242.667±4.8855.667±1.003F/χ212.51713.15713.220P0.0020.0010.001

3 討 論

本次研究在沙鼠泡狀棘球蚴動物模型的基礎(chǔ)上，根據(jù)沙鼠肝臟感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)時(shí)間不同，其病理變化呈動態(tài)改變，通過病灶形態(tài)及特點(diǎn)大致分為3期：感染原頭節(jié)早期14 d內(nèi)，病灶呈結(jié)節(jié)狀“肉芽腫”，血管新生伴大量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，隨著感染時(shí)間延長，病灶中心出現(xiàn)壞死區(qū)；感染中期(14 d～56 d)泡狀棘球蚴組織典型生發(fā)層和角質(zhì)層開始形成，且角質(zhì)層外可見炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞浸潤的增殖區(qū)；感染晚期(56 d后)泡狀棘球蚴組織可見大小不等的囊泡，囊泡周圍有明顯的纖維化帶，與周圍正常肝細(xì)胞界限明顯，周圍正常肝組織內(nèi)血管擴(kuò)張明顯，病灶三期病理特征變化，與相關(guān)研究[13]相符，病程進(jìn)展與接種原頭節(jié)數(shù)量、宿主種類及宿主與原頭節(jié)之間的耐受性密切相關(guān)[14]。

早期對肝泡狀棘球蚴病研究過程中，血管生成常被忽視，隨著對泡型包蟲病的研究深入，血管生成在其病程進(jìn)展中的作用越來越受到關(guān)注。Liu等[15]通過采用CT灌注檢測HAE病變的微循環(huán)，其結(jié)果顯示HAE病變邊緣區(qū)有不同程度的血液灌注，且血流量、血容量及微血管密度具有很好的相關(guān)性。泡狀棘球蚴原頭節(jié)感染肝臟后，細(xì)胞生成因子及趨化因子是炎性細(xì)胞及髓樣細(xì)胞向病變局部歸巢的主要作用因子，同時(shí)也是病灶向周圍正常肝組織細(xì)胞浸潤的重要因子[16]。泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)的血管生成不僅與炎癥細(xì)胞進(jìn)出病灶部位參與免疫逃逸有關(guān)，而且與病灶向周圍正常組織浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。本次研究通過對沙鼠感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后不同時(shí)間點(diǎn)的CD34表達(dá)觀察，其結(jié)果顯示病灶邊緣區(qū)CD34呈陽性表達(dá)，且隨著感染原頭節(jié)時(shí)間延長，病灶邊緣區(qū)CD34表達(dá)不同。病灶早期以結(jié)節(jié)狀肉芽腫形成為主，血管生成伴大量炎性細(xì)胞浸潤，周圍正常肝組織無血管生成；中期隨著病灶中心壞死區(qū)擴(kuò)大，外囊壁的逐漸形成，微血管向周圍正常肝組織中生長，包蟲外囊壁周圍正常肝組織內(nèi)可見MVD-CD34陽性表達(dá)，偶可見炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞浸潤的增殖區(qū)；晚期至終末期，MVD-CD34陽性表達(dá)較早、中期顯著減少。沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)血管生成在病程的早、中期最為顯著，其中病灶中期微血管向周圍正常肝組織內(nèi)浸潤生長，可能是泡狀棘球蚴組織呈腫瘤樣浸潤生長的重要因素。

缺氧是肝臟局部炎癥和血管生成的主要誘導(dǎo)因子，可以作為刺激血管生成的單獨(dú)因素[17-18]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是真核細(xì)胞缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和O2穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子。缺氧條件下，由于缺乏羥化酶所需的激活物，導(dǎo)致HIF-1調(diào)胞質(zhì)內(nèi)蓄積[19]，發(fā)生核轉(zhuǎn)位并與HIF-1β二聚化。HIF二聚體與靶基因啟動子中的缺氧原件(HRE)結(jié)合，上調(diào)許多血管生成基因的表達(dá)誘導(dǎo)血管生成中的細(xì)胞增殖和分裂[20]，包括VEGF、PLGF、PDGFB、AngPT1、AngPT2等，其中VEGF/VEGFR被認(rèn)為是腫瘤血管生成的主要調(diào)控系統(tǒng)。VEGFA是VEGF家族中主要成分，參與腫瘤生長、侵襲、血管生成等過程，是促血管生成的最重要因子[21]。沙鼠感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后不同時(shí)間點(diǎn)泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)HIF-1α與VEGFA的mRNA表達(dá)特征(圖3)，提示在肝臟感染泡狀棘球蚴原頭節(jié)后，局部病灶中HIF-1α可能對VEGFA的表達(dá)具有調(diào)控作用。結(jié)果表明(圖4，5，6)，HIF-1α mRNA在沙鼠肝泡狀棘球蚴組織邊緣區(qū)有不同程度的表達(dá)，其中術(shù)后42 d病灶外囊壁外側(cè)肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)最顯著，局部VEGFA、MVD-CD34同樣高表達(dá)；隨感染時(shí)間延長，感染56 d后HIF-1α mRNA表達(dá)降低，VEGFA、MVD-CD34表達(dá)量隨之降低，這一時(shí)相在病變邊緣區(qū)可能存在HIF-1α上調(diào)VEGFA的表達(dá)促進(jìn)血管生成的級聯(lián)反應(yīng)，以滿足泡狀棘球蚴原頭節(jié)生長所需的氧及其他營養(yǎng)物質(zhì)，具體級聯(lián)通路有待更深入研究。在病灶早期，結(jié)節(jié)狀肉芽組織局部炎癥反應(yīng)明顯，炎性病灶與周圍肝組織無明顯界限，HIF-1α在內(nèi)皮樣浸潤細(xì)胞核中高表達(dá)，肉芽組織中大量微血管生成，而VEGFA在炎癥局部表達(dá)不明顯，在周圍肝組織內(nèi)呈高表達(dá)，考慮在病灶早期，肉芽腫內(nèi)血管生成主要與缺氧引起的炎癥反應(yīng)、纖維化有關(guān)。

肝泡狀棘球蚴組織向周圍正常肝組織呈浸潤生長，加大了手術(shù)治療的難度。血管生長是泡狀棘球蚴組織浸潤性生長的關(guān)鍵因素之一。了解泡狀棘球蚴組織在發(fā)生發(fā)展中血管生成情況及其血管生成機(jī)制可能是治療該疾病的關(guān)鍵所在，有望為該疾病靶向治療提供新思路。

利益沖突：無

引用本文格式：郭黎姣，姜慧嬌，韓歡歡，等.肝泡狀棘球蚴組織中HIF-1α、VEGFA的表達(dá)及對血管生成的作用[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2019，35(7)：639-646. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.083