疫苗對治療和預(yù)防感染十分有效，其中減毒活疫苗可產(chǎn)生較為持久的免疫應(yīng)答，但其安全性常常限制了其臨床應(yīng)用；亞單位疫苗安全性較高，但是免疫原性微弱，通常需要結(jié)合佐劑才能確保其高效的免疫應(yīng)答[1]。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)是一種陽離子聚合物，數(shù)十年來被廣泛應(yīng)用于核酸轉(zhuǎn)染試劑。近年來越來越多的研究表明PEI具有很強的佐劑活性，能夠增強傳統(tǒng)疫苗抗感染和抗腫瘤的效果，有些基于PEI的疫苗已進入臨床研究階段，本文將對PEI疫苗佐劑的研究進展進行綜述。

1 PEI簡介

1.1PEI的合成和理化性質(zhì) PEI是一種合成的陽離子聚合物，由乙烯亞胺-CH2CH2NH-單位鏈組成，其拓撲結(jié)構(gòu)有線性和枝狀兩種形式[2](圖1)，分子量范圍從1 kDa到1 000 kDa。PEI最基本的特征是其高親水性，帶正電的PEI通過靜電相互作用與核酸或帶負電的抗原結(jié)合，進而形成納米級“多聚復(fù)合物”。另外，PEI的骨架中每3個原子就包含一個氮原子[3]，在溶酶體中可形成非晶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，稱之為“質(zhì)子海綿”，它在PEI的功能中發(fā)揮重要作用。

構(gòu)成PEI的活性胺，尤其是伯胺和仲胺，為其結(jié)構(gòu)的修飾提供了多種可能，使PEI靶向目標并減弱其潛在毒性。枝狀PEI包含伯、仲和叔胺，可以通過氮丙啶陽離子開環(huán)聚合而成。而線性PEI(line PEI, LPEI)只包含仲胺，通常來源于聚惡唑啉的酸性水解。所以獲得低分子量LPEI有一定難度。試驗表明伯胺和仲胺有很強的核酸結(jié)合能力，也能靶向試劑、藥物等功能性組分。而叔胺的結(jié)合能力較弱，但它在酸性條件中具有較好的緩沖作用[4-5]。另外，枝狀PEI通常是液態(tài)，而LPEI在室溫下則是固態(tài)，不溶于冷水、苯酚、乙基醚等溶劑，在熱水和有機溶劑(如甲醇、乙醇或氯仿)中溶解性會提高。

圖1 PEI的結(jié)構(gòu)[2]Fig.1 Structure of PEI[2]

1.2PEI的廣泛應(yīng)用 基于PEI的理化性質(zhì)，它被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，包括廢水處理[6]、二氧化碳吸收[7]、蛋白的分離和純化[8]等(表1)。PEI可通過化學(xué)方法大量合成，具備易于質(zhì)控、穩(wěn)定性高、成本低廉等優(yōu)點，因而成為一種被廣泛關(guān)注和研究的新型生物納米材料[9]。1995年，Boussif等首次制備了一種PEI/DNA 納米顆粒(nanoparticles, NPs)，并成功地將DNA轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細胞中[3]。隨后，PEI在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注，尤其是在藥物載體[10]、生物標記[11]和疫苗佐劑方面[12]。

表1 PEI的廣泛應(yīng)用

Tab.1 Wide application of PEI

應(yīng)用PEI配方具體描述參考文獻廢水處理硫脲化PEI絮凝工業(yè)廢水中的陽離子[6]二氧化碳吸附PEI/MCM-36中孔膜強力吸附CO2,同時增強胺的分離能力,提高胺的使用效率[7]蛋白質(zhì)分離PEI-PAA雙層多孔PPE膜提高免疫球蛋白結(jié)合能力[8]抗菌作用聚透明質(zhì)酸-PEI顆粒牙科復(fù)合材料的抗菌活性[17,18]共軛顯像劑雙光子熒光團PEI確定復(fù)合物在HeLa細胞中的攝取和細胞質(zhì)定位[11]結(jié)合核苷酸PEI/DNA;poly-siRNA/PEI復(fù)合物將寡核苷酸導(dǎo)入胚胎神經(jīng)元;促進小鼠黑色素瘤細胞(b16f10)的胞內(nèi)攝取[3,19]結(jié)合肽/蛋白質(zhì)PEI-V24P(10-40)綴合物減少阿爾茨海默病小鼠模型中淀粉樣β積累[20]免疫佐劑HPV16L1-BMP/mPEI/pHPV16L1NPs顯著增強體液免疫應(yīng)答;增加產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細胞數(shù)[12]

注：聚丙烯酸(PAA, polyacrylic acid)；聚乙烯(PPE, polyethylene)；清除肽(V24P(10-40), a scavenger peptide)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP, bone morphogenetic protein)；麥芽糖基化(mPEI, maltosylated PEI)。

PEI傳遞的藥物中最常見的是核酸。如今，PEI轉(zhuǎn)染試劑已經(jīng)商品化，包括ExGen500○R、jetPEI○R和PEIproTM[13]。當PEI與顯像劑(如Fe3O4和熒光NPs)共軛結(jié)合時，也可作為生物標記，在一定條件下反映特異性細胞或亞細胞信息，如細胞遷移等行為[11, 14]。PEI的佐劑效應(yīng)是一個新興的領(lǐng)域。最近的一系列研究表明，基于PEI的疫苗對于治療感染或腫瘤非常有效[15-16]。

2 PEI的免疫激活機制

2.1細胞攝取 疫苗發(fā)揮效應(yīng)的第一步是被抗原遞呈細胞(antigen presented cells, APCs)攝取。與傳統(tǒng)疫苗相比，影響PEI疫苗被細胞攝取的因素包括顆粒大小、形狀、所帶電荷以及顆粒表面化學(xué)性質(zhì)[21-23]。由于PEI分子量大小差異、拓撲結(jié)構(gòu)不同、以及豐富的修飾方式，使得基于PEI的疫苗尺寸、形態(tài)、以及性質(zhì)是多種多樣的，因此PEI疫苗具有廣泛的應(yīng)用。

PEI帶有較強的正電荷，有利于細胞內(nèi)化。PEI結(jié)合細胞表面的帶負電荷的糖蛋白，通過靜電相互作用介導(dǎo)細胞攝取過程[21, 23]。免疫細胞吞噬外源顆粒通常是依賴肌動蛋白[22]，而PEI松散的結(jié)構(gòu)會打亂肌動蛋白，使其重構(gòu)從而引起內(nèi)化。另外，PEI-抗原“多聚復(fù)合物”形成后能作用于細胞表面的硫酸類肝素蛋白聚酶(heparan sulfate proteoglycans, HSPG)，觸發(fā)細胞發(fā)生胞吞作用，促進細胞內(nèi)體的酸化，導(dǎo)致細胞通透性變化，從而使復(fù)合體進入細胞質(zhì)[24]。 而且PEI還可以將帶負電的顆粒凝結(jié)成小粒子，并包裹形成一個光滑的表面[16]，這些球形粒子是對稱的，從任意角度均易被細胞攝取[22]。

2.2抗原遞呈 抗原被細胞攝取后，由不同的細胞區(qū)室處理和轉(zhuǎn)運，最后遞呈到主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)分子(MHC I 和MHC II)的多肽結(jié)合位點，而T細胞受體只能識別這種模式下遞呈的抗原。通常MHC I類分子識別內(nèi)源性肽，誘導(dǎo)細胞免疫；而MHC II類分子識別外源肽，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。PEI疫苗中的抗原肽主要通過MHC II途徑來刺激體液免疫。PEI/DNA疫苗在APCs中合成多個抗原，刺激產(chǎn)生有效的細胞免疫和長期免疫記憶。

如上所述，MHC I類分子識別內(nèi)源性抗原，MHC II類分子識別外源性抗原。但有時MHC I類分子也參與外源性抗原的遞呈，稱之為交叉遞呈，這對生物進化非常有意義。在人類疾病研究中，病毒的侵襲通常不發(fā)生在專職性APCs中，細胞免疫也不會自然發(fā)生[25]。而治療癌癥和感染的疫苗不僅需要體液免疫，更需要細胞免疫，所以交叉遞呈非常重要。在交叉遞呈過程中，被吞噬的抗原逃離溶酶體，進入胞質(zhì)，稱為“溶酶體逃逸”。接著它們進入常規(guī)的泛素化修飾，蛋白酶體降解過程，并被抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，遞呈給MHC I類分子[25-26]。

“溶酶體逃逸”主要是由于滲透壓和膜溶解活性的變化[17]。PEI獨特的“質(zhì)子海綿”結(jié)構(gòu)使它在酸性條件下具有緩沖作用[3, 27]。Merdan等報道了PEI-抗原復(fù)合物的“溶酶體逃逸”過程，通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察PEI/核糖酶在活細胞中的遷移，他們發(fā)現(xiàn)PEI復(fù)合體首先聚集在酸性囊泡(很可能是溶酶體)中，然后小囊泡突然破裂，內(nèi)容物進入細胞質(zhì)[4-5]。PEI在“溶酶體逃逸”過程中，改變pH使PEI疫苗中抗原(肽或DNA)進入細胞質(zhì)中，然后進行交叉遞呈，這一過程最近被Song等再次驗證。他們發(fā)現(xiàn)PEI能將包裹的poly(lactid-glycolide acid)(PLGA)(OVA)NPs通過內(nèi)體逃脫和溶酶體處理遞呈給MHC I類分子，進而誘導(dǎo)有效的抗原交叉遞呈[28](圖2)。

圖2 溶酶體逃逸的過程[28]Fig.2 Process of lysosomal escape[28]

圖3 TLRs信號通路的激活Fig.3 Activation of TLRs signal pathway

2.3PEI免疫激活的分子基礎(chǔ) 經(jīng)PEI處理后許多免疫相關(guān)基因會發(fā)生上調(diào)，揭示引起這種上調(diào)的分子信號通路具有重要意義。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)及其下游髓樣分化因子初次應(yīng)答基因88 (myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88)或含有TIR結(jié)構(gòu)域的適配蛋白誘導(dǎo)干擾素β(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β, TRIF)通路是免疫激活最經(jīng)典的途徑，通過活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)，進而激活一系列細胞因子的表達[25]。Song等體外試驗表明PEI能夠顯著促進BMDCs表面分子CD80的表達，并顯著提高細胞因子IL-6和IL-12p40的分泌[29](圖3)。Huang和Chen等發(fā)現(xiàn)陽離子聚合物(如陽離子右旋糖酐和PEI)可通過TLR4促進巨噬細胞的成熟和I型細胞因子的分泌。另外，研究發(fā)現(xiàn)LPEI可誘導(dǎo)野生型小鼠TLR5下游細胞因子的產(chǎn)生，而在TLR5缺失小鼠中則不能，因此認為LPEI是TLR5受體激動劑，并推測LPEI結(jié)構(gòu)與鞭毛蛋白類似[30]。

Wegmann等研究也證實了PEI的佐劑活性，PEI促進樹突狀細胞(Dendritic cells, DCs)遷移到引流淋巴結(jié)，引起細胞因子的分泌[16]。他們同時證明了PEI的免疫激活機制與干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)依賴信號和NLRP3(NLR family pyrin domain-containing 3)炎性體激活有關(guān)，尤其是在體內(nèi)的過程[16]。NLRP3炎性體是一種存在于APCs中的Nod樣受體(Nod-like receptors, NLRs)。NLRP3炎性體可被各種壓力激活(包括K+流出、活性氧生成和溶酶體破裂等)。因此，PEI-抗原復(fù)合物可能是通過引起溶酶體不穩(wěn)定來激活NLRP3炎性體[16](圖4)。

圖4 PEI激活天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答的機制[16]Fig.4 Mechanism of activating innate and acquired immune responses by PEI[16]

3 PEI疫苗佐劑的應(yīng)用

3.1臨床前研究 構(gòu)建不同的PEI疫苗時，需要選擇不同類型的PEI、抗原、構(gòu)建策略、免疫途徑等。目前廣泛研究的疾病有艾滋病[15, 31]、單增李斯特菌感染[32]、呼吸系統(tǒng)疾病[16, 33]、皰疹病毒感染[34]等(表2)。PEI疫苗可以應(yīng)用于幾乎所有已知的免疫途徑。如對于糖蛋白抗原，Sheppard等研究表明皮下注射和腹腔免疫的兩種方式，添加PEI佐劑均能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)強烈的抗原特異性的抗體應(yīng)答，顯著增加脾臟淋巴細胞中Th1/Th2細胞因子的分泌[15]。Wegmann等研究表明黏膜免疫PEI與流感病毒的HA或 HSV-2 gD抗原可以幫助小鼠抵抗致死性病毒的感染，其效果優(yōu)于處于實驗室階段的其它黏膜佐劑[16]。Song等在小鼠和雞模型中，發(fā)現(xiàn)PEI能顯著增強鼻腔和肺黏膜中HA1-2特異性IgG和IgA抗體水平，并且在雞攻毒后，其喉頭和泄殖腔拭樣中病毒載量顯著低于未添加佐劑組[35]。以上研究均表明PEI是一種極具潛力的疫苗佐劑。

3.2臨床研究 臨床試驗是用來評價一種新開發(fā)疫苗最有力的證據(jù)。PEI疫苗在一系列的體內(nèi)實驗中取得了理想的研究結(jié)果，而且也有少數(shù)進行到臨床試驗階段[36-38]，其中較為重要的是DermaVir(糖基化-PEI/猴艾滋病毒DNA質(zhì)粒)。Lisziewicz等在體外將DermaVir接種DCs，發(fā)現(xiàn)DermaVir轉(zhuǎn)入單核細胞衍生的DCs后可誘導(dǎo)恒河猴產(chǎn)生HIV特異性T細胞[39]。與之前基于DCs接種疫苗相比，這種疫苗接種策略在淋巴結(jié)也產(chǎn)生同樣數(shù)量的DCs，誘導(dǎo)相似水平的HIV特異性Th1細胞免疫應(yīng)答。DermaVir Patch目前進行到I / II期臨床試驗階段，Rodriguez等給25名感染HIV慢性患者使用了劑量遞增的治療性疫苗候選DermaVir或與之匹配的安慰劑。研究發(fā)現(xiàn)重復(fù)劑量免疫DermaVir后，耐受性良好，無劑量限制毒性，不良反應(yīng)較輕，各研究組之間不良反應(yīng)發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異。DermaVir可以在感染者中誘導(dǎo)HIV特異性的中樞記憶T細胞應(yīng)答，是一種安全的治療性疫苗候選[40]，見表3。

表2 PEI相關(guān)疫苗的臨床前研究

Tab.2 Preclinical studies of PEI-related vaccines

序號疫苗動物模型抗原疫苗作用效果參考文獻1mPEI/pVAX1-HIVgagDNABALB/cHIV(pVAX1-HIVgag)促進IgG2αT細胞應(yīng)答和細胞因子的產(chǎn)生,甚至在低DNA劑量下也顯著升高[31]2LPEI或BPEI/HIV-gp140BALB/cC57BL/6JHIV-1(gp140)增強抗原特異性血清IgG的產(chǎn)生;將嗜中性粒細胞招募到給藥位點;增強APCs對抗原的遞呈[15]3LPEI或JetPEI/DNABALB/cC57BL/6JL.monocytogenes(OVA)體內(nèi)DNA表達增加20-400倍;CD8+T細胞應(yīng)答增強10-25倍;分泌Th1細胞因子的細胞數(shù)量增加;提高抗原特異性Th1細胞和體液應(yīng)答[32]4PEI/pci-SDNABALB/cSARS-CoV(pci-S)與pci-S對照相比,顯著提高抗原特異性血清IgG1、肺黏膜IgA抗體滴度;增加脾臟中B220+細胞數(shù);增強DC表面分子的表達;增加分泌IFN-γ/TNF-α/IL-2的T細胞數(shù)[33]5BPEI/HAC57BL/6JInfluenza(HA)增強免疫保護,提高HA特異性血清IgG1、IgG2a及IgA抗體滴度[16]6PEI/pRSC-gD-IL-21DNABALB/cHSV(pRSC-gD-IL-21)促進眼淚sIgA、血清中IFN-γ/IL-4的產(chǎn)生;增強細胞毒性NK細胞,脾臟淋巴細胞增殖;小鼠眼黏膜HSK程度低于對照組[34]7HPV16L1-MBP/mPEI/pHPV16L1DNABALB/cHPV(16L1DNA和16L1多肽)與單獨蛋白和蛋白/DNA混合物相比,蛋白質(zhì)/DNA共遞送疫苗促進全身性IgG和黏膜IgA的產(chǎn)生;增強脾臟CD8+T細胞誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生能力[12]

注：糖蛋白(gp, glycoprotein)；單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes,Listeriamonocytogenes)；pci-S(SARS DNA vaccine)；嚴重急性呼吸綜合征(SARS, severe acute respiratory syndrome)；冠狀病毒(CoV, coronavirus)；枝狀PEI(BPEI, branched PEI)；血凝素(HA, hemagglutinin)；pRSC(mock plasmid)；單純皰疹病毒(HSV, herpes simplex virus)；皰疹基質(zhì)角膜炎(HSK, herpes stromal keratitis)；人乳頭瘤病毒(HPV, human papillomavirus)。

表3 PEI相關(guān)疫苗的臨床研究

Tab.3 Clinical studies of PEI-related vaccines

序號疫苗臨床等級抗原疫苗作用效果參考文獻1DermaVirI/IIpDNA/HIV(15種抗原)在受試者中均檢測到HIV特異的CD4+和CD8+T細胞,其中IFN-γ和IL-2均顯著表達,且產(chǎn)生的HIV特異的記憶性T細胞具有較高的增殖能力[36,40]2GEN-1IpDNA/PEG-PEI-Cholesterol接種疫苗后,57.1%的病人的病癥得到緩解且病情穩(wěn)定,且病人腹水中IL-12、IFN-γ和TNF-α顯著增加[37]3EGEN-001IIpDNA/PEG-PEI-cholesterol接種疫苗后,部分受試者出現(xiàn)頭暈、發(fā)熱或貧血,但是所有病人均未出現(xiàn)全身性嚴重副反應(yīng),35%的病人的病情穩(wěn)定[38]

注：聚乙二醇(PEG， poly(ethylene glycol))；膽固醇(Cholesterol)。

4 PEI使用的安全性

PEI是目前研究較多的一類非病毒載體材料，較高相對分子質(zhì)量的PEI具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但同時細胞毒性也較大，相對分子質(zhì)量較低的PEI雖細胞毒性較小，但轉(zhuǎn)染效率卻很低。因此，不少研究者嘗試通過可降解的化學(xué)鍵耦聯(lián)相對分子質(zhì)量低的PEI形成PEI耦聯(lián)產(chǎn)物，使其能夠在體內(nèi)自行降解為小片段并代謝清除，從而降低細胞毒性。如Ge等[41]通過可降解的氨基甲酸酯化學(xué)鍵耦聯(lián)低相對分子質(zhì)量PEI 800，制備得到新型非病毒納米載體PEI-Bu，有利于降低PEI載體的毒性。Peng等[42]合成的二硫鍵交聯(lián)的PEI-SSX系列載體，與PEI 25000相比，具有較低的毒性和較高的轉(zhuǎn)染活性。

近年來，隨著PEI作為佐劑的研究越來越多，其作為疫苗接種和免疫治療的安全性也備受關(guān)注。其中，甘露糖化的PEI 25000因其良好的佐劑活性成為人們關(guān)注的焦點。為了降低其細胞毒性，Li等[31]通過連接PEI 2000和PEI 600，用三甘醇作為交聯(lián)劑，合成了一種新的可生物降解的甘露糖基PEI聚合物，顯著減低其細胞毒性。Lee等[43]采用反相油包水乳液/交聯(lián)法在線性聚乙烯亞胺PEI/透明質(zhì)酸HA水凝膠中制備了cGAMP，并證實是可用作疫苗接種和免疫治療的安全有效的佐劑。同樣的，Wegmann等[16]人也支持這一觀點，他們證明PEI是一種安全有效的糖蛋白疫苗佐劑。對于皮下免疫，選擇80～100 g PEI作為小鼠的最佳劑量范圍，因為該劑量可誘導(dǎo)強有力的佐劑效應(yīng)，同時僅在免疫后第1 d引起中度體重減輕，與獲批的鋁佐劑(1mg Al(OH)3)引起的體重減輕相比更低或在統(tǒng)計上難以區(qū)分。當然，人們依然很擔心PEI在一定條件下產(chǎn)生不良影響，但是沒有明顯的證據(jù)表明其作為疫苗佐劑對動物或人類有直接毒性。因此, 在未來的研究中，將進行全面和長期的評價，進一步表征PEI聯(lián)合制劑用于人類疫苗的耐受性。

5 展 望

盡管目前疫苗佐劑已經(jīng)有了廣泛的研究，但其發(fā)展的速度相對緩慢。鋁是近一個世紀使用最廣泛的佐劑，具有許多優(yōu)點，如安全性好并誘導(dǎo)高滴度抗體產(chǎn)生，但是它不能引起細胞免疫應(yīng)答。此外，只有少數(shù)佐劑被許可用于腫瘤免疫治療，因此，需要在疫苗配方中開發(fā)新的可同時誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫的疫苗佐劑。此外，PEI與其它TLR配體的聯(lián)合使用可能改變宿主免疫應(yīng)答類型，進而篩選更為優(yōu)良的佐劑組合。例如研究證實PEI與TLR9配體CpG聯(lián)合使用能夠協(xié)同增強獲得性免疫應(yīng)答，并使免疫應(yīng)答偏向Th1型[15]，因此在未來的研究中PEI與其它佐劑的聯(lián)合使用值得進一步嘗試。

PEI具有誘導(dǎo)免疫細胞“危險信號”和促炎細胞因子產(chǎn)生的能力，這是其佐劑活性的基礎(chǔ)。鑒于PEI對免疫系統(tǒng)的作用研究和報道有限，對其免疫佐劑機制的深入理解具有十分重要的意義。此外，不同大小和形狀、不同的免疫途徑和修飾策略的PEI疫苗在體內(nèi)的生物學(xué)分布和降解還需要進一步研究[44]。

利益沖突：無

引用本文格式：宋麗，熊丹，焦新安，等.聚乙烯亞胺作為核酸疫苗佐劑的研究進展[J].中國人獸共患病學(xué)報，2019，35(7)：660-666,671. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.62