王帥康 劉鳳蓮 徐曉蝶 衷志剛 王亞芳 牟敏捷 王學(xué)斌

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005)

下丘腦弓狀核(ARC)是端腦底部的一個(gè)核團(tuán)，其神經(jīng)元含腦啡肽、β-內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽等多種與鎮(zhèn)痛作用相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，參與痛覺(jué)相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)〔1〕；在結(jié)構(gòu)上，ARC具有十分廣泛的傳出和傳入纖維，與前腦、邊緣系統(tǒng)、中腦、腦橋和延髓中的多個(gè)鎮(zhèn)痛相關(guān)核團(tuán)(如中縫背核、藍(lán)斑核等)相聯(lián)系〔2,3〕。電刺激或藥物刺激ARC有明顯的鎮(zhèn)痛作用，電凝損毀弓狀核，可導(dǎo)致腦內(nèi)-內(nèi)啡肽等鎮(zhèn)痛物質(zhì)含量明顯下降，而血漿中的相關(guān)鎮(zhèn)痛物質(zhì)含量則沒(méi)有明顯改變〔4,5〕。

催產(chǎn)素(OT)是下丘腦室旁核、視上核的大神經(jīng)元產(chǎn)生的由9個(gè)氨基酸殘基組成的肽類(lèi)激素。OT的生理作用很廣泛，包括對(duì)子宮、乳腺、垂體、心血管功能、胃運(yùn)動(dòng)和分泌等都具有一定的調(diào)節(jié)作用，并可影響性行為、母性行為、應(yīng)激反應(yīng)、學(xué)習(xí)記憶等生理功能〔6〕。研究表明，OT在痛覺(jué)與鎮(zhèn)痛功能的調(diào)節(jié)中也具有重要作用，如腦室內(nèi)注射OT可觀察到明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)；電刺激是室旁核細(xì)胞，OT含量升高，動(dòng)物痛閾降低〔7,8〕。有關(guān)OT在ARC內(nèi)的痛覺(jué)調(diào)制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以腦內(nèi)微量注射技術(shù)和傷害性熱刺激和壓力刺激引起大鼠后爪縮爪反應(yīng)的行為測(cè)定方法，記錄其反應(yīng)潛伏期的變化，研究OT在大鼠ARC內(nèi)對(duì)痛覺(jué)調(diào)制作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)采用健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司提供)，體重200～220 g。實(shí)驗(yàn)期間分籠單獨(dú)飼養(yǎng)，自然光照周期，自由進(jìn)食和飲水。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組8只。

1.2 痛閾測(cè)試 動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，先使之適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境4 d。實(shí)驗(yàn)前先分別用YLS-6B型智能熱板儀和YLS-3E型電子壓痛儀進(jìn)行后爪的熱痛和壓痛痛閾測(cè)試訓(xùn)練，訓(xùn)練進(jìn)行4 d，每天一輪，剔除痛覺(jué)感受不穩(wěn)定或同一條件下測(cè)試數(shù)據(jù)差異較大的動(dòng)物。

1.2.1 熱痛閾測(cè)試 熱痛閾測(cè)試儀的熱板溫度設(shè)置為52℃(51.5～52.5℃)。以左手持握大鼠，右手輕持大鼠的待測(cè)后肢，使其后爪完全伸展，并平鋪于熱板儀上，爪掌全部貼附于熱板表面。自后爪開(kāi)始接觸熱板時(shí)起計(jì)時(shí)，至大鼠主動(dòng)回縮，后爪離開(kāi)熱板表面時(shí)停止計(jì)時(shí)，以?xún)x器顯示的該時(shí)間段作為大鼠對(duì)熱傷害性痛刺激的后爪縮爪反應(yīng)潛伏期(HWL)。

1.2.2 壓痛閾測(cè)試 用壓力測(cè)痛儀進(jìn)行測(cè)試，左手執(zhí)大鼠，右手將大鼠后爪平放于壓力測(cè)痛儀的小平臺(tái)上，楔形有機(jī)玻璃壓住大鼠后爪的跗趾關(guān)節(jié)背側(cè)。啟動(dòng)儀器，以30 g/s的速度增加壓力，從開(kāi)始加壓到大鼠主動(dòng)縮回后爪的時(shí)間段記為大鼠對(duì)機(jī)械傷害性壓痛刺激的HWL。

1.3 前扣帶回(ACC)內(nèi)微量注射方法 在大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.4 ml/100 g)進(jìn)行麻醉。然后將其頭部固定在腦立體定位儀，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜〔9〕，選定ARC的坐標(biāo)(L/R ±0.5 mm，AP-4.0 mm,H 9.8 mm)。于雙側(cè)顱骨相應(yīng)部位開(kāi)顱、插管(外徑0.8 mm)并以牙科水泥固定。腹腔注射青霉素(10萬(wàn)U/只)以防感染。將動(dòng)物置入單籠待其清醒，使動(dòng)物休息、恢復(fù)4～5 d后進(jìn)行行為痛覺(jué)測(cè)試，穩(wěn)定后進(jìn)行核團(tuán)微量注射。將微量注射器針管插入套管，緩慢注射藥物，每次注射后使注射針在管內(nèi)停留40 s再將之取出。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用1 μl微量注射器連接內(nèi)管(直徑0.4 mm)，并插入外管進(jìn)行藥物注射，每天注射1次/只，每次藥物劑量為1 μl。藥物注射后，分別測(cè)定第5、10、15、20、30、45、60 min時(shí)動(dòng)物的熱痛和壓痛閾。注射的藥物包括不同濃度OT或其受體拮抗劑CAP518(atosiban)，對(duì)照組注射同劑量生理鹽水。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)完成后，開(kāi)顱取腦，冰凍橫切，尋找注射位點(diǎn)，剔除注射位點(diǎn)有誤動(dòng)物的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，保留注射位點(diǎn)正確的數(shù)據(jù)。采用STA_BAS軟件進(jìn)行方差分析t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 ARC內(nèi)微量分別注射生理鹽水(對(duì)照)或不同濃度(1、5或10 nmol/μl)催產(chǎn)素后大鼠HWL 隨著OT濃度的增加，鎮(zhèn)痛作用也明顯加強(qiáng)，鎮(zhèn)痛作用在峰值在20 min左右。隨后可能隨著腦內(nèi)OT降解，鎮(zhèn)痛效應(yīng)逐漸下降；至60 min時(shí)基本回到原初水平。見(jiàn)圖1。

圖1 ARC內(nèi)微量分別注射1 μl生理鹽水(對(duì)照)或不同濃度(1、5或10 nmol/μl)催產(chǎn)素后大鼠HWL

注射10 nmol/μl OT后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果：熱板痛閾左側(cè)：F=139.253，P<0.01；右側(cè)：F=143.785，P<0.01；壓力痛閾測(cè)試左側(cè)：F=136.356，P<0.01;右側(cè)：F=139.123,P<0.01；注射5 nmol/μl OT后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果：熱板痛閾左側(cè)：F=96.583，P<0.01；右側(cè)：F=89.653，P<0.01；壓力痛閾測(cè)試左側(cè)：F=93.235，P<0.01;右側(cè)：F=88.569,P<0.01；注射1 nmol/μl OT后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果：熱板痛閾左側(cè)：F=29.244，P<0.01；右側(cè)：F=27.993，P<0.01；壓力痛閾測(cè)試左側(cè)：F=24.763，P<0.01;右側(cè)F=22.336,P<0.01。這些結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在大鼠弓狀核內(nèi)注射不同濃度的OT(1、5或10 nmol/μl)后，均具有顯著或極顯著的對(duì)熱痛或壓痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

2.2 ARC內(nèi)微量分別先注射5 nmol/μl的OT 1 μl，再注射生理鹽水(對(duì)照)或不同濃度的CAP518溶液1 μl后大鼠HWL 隨著CAP518濃度的增加，鎮(zhèn)痛作用的抑制效應(yīng)也明顯加強(qiáng)，峰值在20 min左右。隨后可能隨著腦內(nèi)CAP518的降解，鎮(zhèn)痛效應(yīng)逐漸下降；至60 min時(shí)基本回到原初水平。見(jiàn)圖2。

與先注射5 nmol OT，再注射生理鹽水的實(shí)驗(yàn)組相比，先注射5 nmol/μl OT，再注射10 nmol/μl CAP518的統(tǒng)計(jì)結(jié)果：熱板痛閾左側(cè)：F=89.368，P<0.01；右側(cè)：F=85.578，P<0.01；壓力痛閾測(cè)試左側(cè)：F=185.634，P<0.01;右側(cè)：F= 88.356,P<0.01；先注射5 nmol/μl OT，再注射5 nmol/μl CAP 518的統(tǒng)計(jì)結(jié)果：熱板痛閾左側(cè)：F=19.896，P<0.01；右側(cè)：F=15.368，P<0.01；壓力痛閾測(cè)試左側(cè)：F=17.782，P<0.01;右側(cè)：F=14.685,P<0.01；先注射5 nmol/μl OT，再注射1 nmol/μl CAP 518的統(tǒng)計(jì)結(jié)果：熱板痛閾左側(cè)：F=4.566，P<0.05；右側(cè)：F=5.143，P<0.05；壓力痛閾測(cè)試左側(cè)：F=4.356，P<0.05;右側(cè)：F=5.235,P<0.05。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與注射生理鹽水組相比，在大鼠弓狀核內(nèi)注射5 nmol/μl的催產(chǎn)素再注射生理鹽水(對(duì)照)或不同濃度(1、5或10 nmol/μl)的CAP518溶液后，對(duì)OT的鎮(zhèn)痛作用均具有顯著或極顯著的抑制效應(yīng)(P<0.05或P<0.01)。

圖2 ARC內(nèi)微量分別先注射5 nmol/μl的催產(chǎn)素1 μl，再注射生理鹽水(對(duì)照)或不同濃度的CAP518溶液1 μl后大鼠

3 討 論

下丘腦ARC是腦內(nèi)多個(gè)鎮(zhèn)痛核團(tuán)之一，其內(nèi)的β-內(nèi)啡肽能神經(jīng)元是其產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)的主要原因。目前對(duì)ARC的研究主要集中于通過(guò)電刺激或注射藥物(如谷氨酸單鈉)等來(lái)探究其鎮(zhèn)痛效應(yīng)。催產(chǎn)素在其他核團(tuán)(如伏核、韁核)中具有一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)；低濃度催產(chǎn)素施予外周神經(jīng)可形成痛敏區(qū)，施用高濃度催產(chǎn)素則能夠脫敏。

本文結(jié)果與其他研究一致。李小永〔5〕研究表明，ARC內(nèi)注入谷氨酸或NMDA均可使大鼠鎮(zhèn)痛指數(shù)明顯提高，且呈劑量依賴(lài)性。高慶軍等〔10〕報(bào)道，在大鼠僵核內(nèi)微量注射OT，具有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。劉文彥等〔11〕研究表明，尾狀核內(nèi)OT參與大鼠痛行為調(diào)制的復(fù)雜過(guò)程，引起痛行為反應(yīng)的閾值增加，該作用不完全依賴(lài)于內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)。因此，OT與ARC相互作用的機(jī)制可能非常復(fù)雜，在情緒整合、內(nèi)臟活動(dòng)、感覺(jué)信息、痛覺(jué)調(diào)制及內(nèi)分泌功能中起重要作用。當(dāng)機(jī)體受到痛覺(jué)刺激而發(fā)生生理和心理變化時(shí)，來(lái)自腦干的內(nèi)臟控制中樞，來(lái)自下丘腦的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)控中樞，來(lái)自邊緣系統(tǒng)的情緒調(diào)控中樞的信息均可傳至ARC，在此進(jìn)行整合，通過(guò)內(nèi)源性O(shè)T、內(nèi)啡肽等分泌含量的變化，通過(guò)OT特異性受體或阿片肽受體系統(tǒng)，調(diào)節(jié)痛與鎮(zhèn)痛效應(yīng)閾值，使機(jī)體各部分發(fā)生相應(yīng)的變化，以保證機(jī)體避開(kāi)有害刺激，維護(hù)身體的正常功能。

綜上，在大鼠ARC內(nèi)，外源性O(shè)T具有明顯的鎮(zhèn)痛作用；這種作用與ARC內(nèi)OT的受體活動(dòng)有關(guān)；這種鎮(zhèn)痛效應(yīng)可持續(xù)1 h左右。本文可為ARC及OT在臨床上鎮(zhèn)痛應(yīng)用提供理論參考。關(guān)于OT在ARC內(nèi)是否通過(guò)阿片肽受體發(fā)揮作用，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。