王鳳嬌 高翔 孔淑琦 張建林 劉祺 尹航 王夢潔 王曉丹 牟青杰 楊娜娜

(1濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心，山東 濰坊 261000；2泰山醫(yī)學(xué)院；3泰安市中心醫(yī)院)

動脈粥樣硬化患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)較健康人明顯下降〔1〕，并且EPCs增生、遷移、成血管等功能受損〔2～4〕。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，心腦血管疾病EPCs數(shù)量和功能與炎癥等眾多危險因子成負(fù)相關(guān)關(guān)系〔4〕，例如腫瘤壞死因子(TNF)-α。TNF-α是冠心病的獨(dú)立危險因素之一〔5〕，能預(yù)測冠狀動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性及急性冠狀動脈綜合征的嚴(yán)重程度〔6〕，并且明顯損傷EPCs的功能〔7〕，因此如何提高心血管疾病患者EPCs功能，修復(fù)損傷血管內(nèi)膜是心血管疾病前期預(yù)防和治療的關(guān)鍵之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食小鼠體內(nèi)血漿TNF-α水平與體內(nèi)循環(huán)EPCs數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，且顯著損傷EPCs增殖、遷移和成血管功能，高密度脂蛋白模擬肽(Rev-D4F)能顯著改善TNF-α誘導(dǎo)的上述損傷作用〔8〕。然而Rev-D4F是否對TNF-α誘導(dǎo)EPCs凋亡和黏附功能的損傷具有修復(fù)作用并不清楚。本實驗通過提前用Rev-D4F干預(yù)EPCs 6 h，觀察Rev-D4F是否能抑制TNF-α誘導(dǎo)EPCs的凋亡，并修復(fù)TNF-α誘導(dǎo)EPCs黏附功能的損傷。

1 材料與方法

1.1 EPCs分離 4～6周齡C57小鼠麻醉后脫臼處死，75%乙醇浸泡后取股骨，用M199培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，反復(fù)吹打直至沖洗液清亮，濾網(wǎng)過濾后沖洗液與 Ficoll分離液的體積比為1∶1，室溫2 000 r/ min離心20 min，輕輕吸取中間乳白色云霧狀細(xì)胞層到新的離心管中，M199清洗沉淀細(xì)胞2次，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按 106/cm2的密度接種在包被Fibronectin的培養(yǎng)瓶中，每3 d更換條件培養(yǎng)基 EGM-2MV〔9〕。

1.2 EPCs鑒定EPCs 在37℃與 2.5 mg/L的DiI-acLDL孵育2 h，多聚甲醛固定后，與10 mg/L的荊豆凝集素(FITC-UEA)于37℃孵育1 h，中性甘油封片，用熒光顯微鏡觀察。

1.3 實驗分組 培養(yǎng)的晚期EPCs分為三組：①對照組：含5%血清的M199培養(yǎng)基；②TNF-α組：用含5%血清的M199培養(yǎng)基配置的30 ng/ml TNF-α溶液；③Rev-D4F組：用含5%血清的M199培養(yǎng)基配置的50 μg/ml Rev-D4F溶液干預(yù)細(xì)胞6 h后，用含5%血清的M199培養(yǎng)基配置的30 ng/ml TNF-α溶液處理細(xì)胞。

1.4 黏附功能檢測 不同組別EPCs胰酶消化后接種于96孔培養(yǎng)板中，孵育 30 min，PBS 沖洗 3 次，每孔隨機(jī)取 5 個視野(× 40)計數(shù)。

1.5 凋亡檢測 胰酶消化細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細(xì)胞兩次，加入5 μl Annexin V-FITC，孵育10 min，加入5 μl碘化丙啶(PI)孵育5 min，加入400 μl PBS上機(jī)檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs型態(tài)和鑒定 根據(jù)本課題組前期對小鼠骨髓EPCs培養(yǎng)條件研究，采用3 d貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d發(fā)現(xiàn)克隆，繼續(xù)傳代培養(yǎng)20 d呈長梭形。見圖1。培養(yǎng)14 d細(xì)胞進(jìn)行吸附低密度脂蛋白和結(jié)合凝集素實驗發(fā)現(xiàn)，約70%細(xì)胞能吸附低密度脂蛋白并結(jié)合凝集素(見圖2)，為正在分化的EPCs。

2.2 Rev-D4F對TNF-α誘導(dǎo)EPCs凋亡的影響 與對照組〔凋亡率(7.9±0.33)%〕相比，TNF-α組顯著促進(jìn)EPCs凋亡〔凋亡率(29.7±0.75)%〕，提前6 h加入50 μg/ml Rev-D4F顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的EPCs凋亡〔凋亡率(17.6±1.41)%〕，見圖3。

圖1 小鼠骨髓單個核細(xì)胞不同培養(yǎng)時間EPCs型態(tài)(×40)

圖2 EPCs鑒定(×40)

圖3 Rev-D4F抑制TNF-α誘導(dǎo)的EPCs凋亡

2.3 Rev-D4F提高EPCs黏附功能 根據(jù)前期研究結(jié)果，選取了TNF-α和Rev-D4F的劑量分別為30 ng/ml和50 μg/ml〔8〕。黏附功能檢測發(fā)現(xiàn)，TNF-α對EPCs黏附功能并無顯著影響〔TNF-α組黏附細(xì)胞數(shù)(6.9±0.83)個，對照組(6.8±0.72)個〕，Rev-D4F三組提前6 h加入50 μg/ml Rev-D4F的EPCs能顯著提高EPCs的黏附功能〔(8.8±0.72)個〕。

3 討 論

多項研究表明，體內(nèi)循環(huán)中EPC數(shù)量的減少不僅與內(nèi)皮功能降低有關(guān)〔4〕，而且與心血管疾病〔10,11〕、側(cè)支形成減少〔12〕和加重心血管疾病的進(jìn)程有關(guān)〔13〕。而自體EPCs移植由于存在本身功能缺陷等問題，阻礙了自體細(xì)胞治療心血管疾病的應(yīng)用，因此，EPCs移植前后的藥物調(diào)節(jié)可能是提高其治療心血管疾病潛能的一種新方法〔14〕。

Rev-D4F是一種改良的D4F，它通過抑制內(nèi)皮炎癥和改善高密度脂蛋白功能，降低主動脈竇動脈粥樣硬化病變面積〔15〕。前期發(fā)現(xiàn)Rev-D4F通過磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)途徑改善小鼠骨髓來源的EPC功能，對TNF-α誘導(dǎo)的小鼠骨髓來源的EPC增殖、遷移和成血管功能損傷具有修復(fù)作用〔8〕，本實驗前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究Rev-D4F對TNF-α誘導(dǎo)的小鼠骨髓來源的EPC黏附功能和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α(30 ng/ml)促進(jìn)EPCs凋亡，但TNF-α(30 ng/ml)對EPCs黏附并沒有作用，Rev-D4F預(yù)先干預(yù)能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的EPCs凋亡，提高EPCs黏附功能。