周宜燦 潘曉東

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 福州 350001)

阿爾茨海默病(AD)是與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性障礙疾病，起病隱匿，病程緩慢且不可逆。臨床表現(xiàn)為認(rèn)知能力的下降、記憶力下降及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)，分為早老性癡呆和老年性癡呆〔1～3〕。AD的主要病理學(xué)改變?yōu)槟X中神經(jīng)突起-淀粉樣斑塊(NP)沉積及神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)。其中β淀粉樣蛋白(Aβ)為沉淀的主要成分，是由淀粉樣前體蛋白(APP) 經(jīng) β-和 γ-分泌酶的蛋白水解作用而產(chǎn)生。Aβ1～40和Aβ1～42是最常見的Aβ亞型，但是Aβ1～42更容易形成Aβ的核心從而造成毒性損害〔4〕。miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小為20～25個(gè)核苷酸，miRNAs涉及多種生理過程的發(fā)生及脂肪的代謝，包括生命的發(fā)育、機(jī)體免疫、細(xì)胞增殖與凋亡〔5〕。研究表明，miR-129與多種實(shí)體腫瘤疾病有關(guān)，如乳腺癌，胃癌〔6〕；同時(shí)也與神經(jīng)系統(tǒng)的疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如膠質(zhì)瘤等。本研究運(yùn)用新生大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞于體外建立AD細(xì)胞模型，擬觀察miR-129在其發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)新生健康SD大鼠，酒精消毒，斷頭取腦組織并將其至于預(yù)先準(zhǔn)備好的Hank平衡鹽溶液(HBSS)中，分離雙側(cè)海馬，剔除表面腦膜及血管組織，加入0.125%胰蛋白酶，置于37℃ 水浴振蕩消化10 min，吸除胰蛋白酶，HBSS洗滌2次，加入適量培養(yǎng)基重懸，70 μm篩網(wǎng)過濾，接種于高糖DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、1% GlutaMax)，貼壁后，更換培養(yǎng)基。Aβ處理構(gòu)建AD細(xì)胞模型。細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、miR-129敲低組、miR-129過表達(dá)組、miR-129敲低+Aβ處理組、miR-129過表達(dá)+Aβ處理組、APP siRNA組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine2000。miR-129過表達(dá)載體(pGCMV/EGFP/miR-129)及對(duì)照載體(pGCMV/EGFP/miRNC)均由上海吉瑪公司構(gòu)建。

1.2 Q-PCR檢測(cè)APP mRNA表達(dá)水平 各組細(xì)胞處理完畢后，Trizol(Invitrogen，美國(guó))裂解提取RNA，以25℃ 10 min,50℃ 30 min,85℃ 5 min為條件逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，以cDNA作為模板完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR。基因的引物采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)。miR-129引物為通用引物，APP上游引物：5′-GGGTAGAGTTTGTGTGTTGCC-3′;下游引物：5′-TCTTCTTCCACCTCAGCCAC-3′。

1.3 膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-碘化丙啶(PI)雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 運(yùn)用Annexin V-FITC/PI (碧云天，C1062)雙染檢測(cè)各組凋亡率，各組細(xì)胞處理完畢，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，收集上清液離心，接著使用濃度為0.25%不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液濃度1×106個(gè)細(xì)胞/ml，2 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，收集細(xì)胞，用200 μl緩沖液重懸，分別加入5 μl FITC和10 μl PI，4℃避光孵育15 min。用PBS將懸液補(bǔ)充至700 μl，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 消化處于對(duì)數(shù)期的神經(jīng)元細(xì)胞，接種于96孔板中，保持細(xì)胞濃度5×103/孔，培養(yǎng)24 h后，換液。每組設(shè)置3個(gè)副孔，培養(yǎng)24 h，加入MTT(5 g/L，碧云天，C0009)各20 μl，4 h 后吸出培養(yǎng)液，接著加入二基亞砜(DMSO)150 μl，輕微振蕩5 min溶解結(jié)晶，同時(shí)注意避光，最后在570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(C)值。

1.5 Western印跡檢測(cè)蛋白水平表達(dá) 放射免疫沉淀(RIPA)1640(碧云天，P0013B)強(qiáng)裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，并將蛋白于-80℃冰箱保存。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)模，封閉后，孵育一抗，4℃冰箱過夜。次日孵以二抗，冷CCD成像系統(tǒng)觀察蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)和q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ處理與miR-129表達(dá)水平的關(guān)系 用10 μmol/L Aβ分別處理常用的神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12及海馬神經(jīng)元細(xì)胞24 h，模型組miR-129表達(dá)水平(0.35±0.03、0.31±0.02)顯著低于對(duì)照組(1.05±0.02、1.08±0.01，t=3.62、3.99，P<0.05)。

2.2 各組凋亡率與細(xì)胞活力比較 模型組凋亡率(40.91%)明顯高于對(duì)照組(4.05%,P<0.05)，miR-129過表達(dá)+Aβ處理組(22.47%)、miR-129敲低+Aβ處理組(48.16%)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組細(xì)胞活力(44.36%)顯著低于對(duì)照組(92.89%)，miR-129過表達(dá)+Aβ處理組(55.46%)、miR-129敲低+Aβ處理組(39.23%)與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.3 miR-129 過表達(dá)與APP mRNA的關(guān)系 miR-129過表達(dá)組APP mRNA(0.60±0.02)顯著低于對(duì)照組(1.80±0.01，P<0.05)，見圖2。

2.4 抑制APP表達(dá)后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的比較 模型組凋亡率(53.71%)顯著高于對(duì)照組(4.60%，P<0.05)。APP siRNA組(20.54%)顯著低于模型組(P<0.05)。見圖3。

圖1 各組凋亡率比較

圖2 miR-129 過表達(dá)與APP mRNA的關(guān)系

圖3 抑制APP表達(dá)后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的比較

3 討 論

AD是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，主要的病理特征為集中在大腦海馬區(qū)的Aβ在細(xì)胞外沉積形成老年斑(SP)，而β分泌酶(BACE1)是Aβ生成的限速酶〔7〕。tau蛋白的過度磷酸化所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纏結(jié)，腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的減少及新皮層、腦血管的改變。Aβ作為機(jī)體的正常代謝物，可以由APP水解得來〔8〕。但當(dāng)APP的功能出現(xiàn)了異常，就會(huì)導(dǎo)致Aβ的異常沉積，最終造成神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。同時(shí)AD也有可能由氧化應(yīng)激和炎癥所導(dǎo)致〔9〕。

miRNA是約含有22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可以通過調(diào)節(jié)相應(yīng)的靶基因參與到分化發(fā)育、細(xì)胞增殖凋亡等過程中。組織或血清中miRNA的異常表達(dá)在惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用〔10〕。而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的miRNA則可能參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能。研究表明miRNA在調(diào)控AD 等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病中起重要作用，且miRNAs 網(wǎng)絡(luò)的改變?cè)黾恿薃D的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔11〕。有研究表明，miRNA-129在胃癌組織中異常表達(dá)，其表達(dá)水平與晚期胃癌患者預(yù)后顯著相關(guān)，其表達(dá)水平可作為潛在的胃癌預(yù)后判斷指標(biāo)，也可作為化療法的潛在評(píng)價(jià)指標(biāo)〔12〕，說明miR-129具有多種生物學(xué)功能。本研究通過培養(yǎng)海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞，運(yùn)用Aβ來進(jìn)行體外AD模型的構(gòu)建，結(jié)果說明miR-129參與了AD的過程。miR-129可能通過抑制APP的活性來減少Aβ造成的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。

綜上，miR-129在AD模型中處于一個(gè)低表達(dá)狀態(tài)，但當(dāng)過表達(dá)miR-129后可以有效減輕神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，且可能通過抑制APP的活性來減少Aβ造成的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。