朱彩英 陳武煉 杜 明 徐叢劍,3

(1 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院宮頸疾病診療中心 上海 200011;2 復(fù)旦大學(xué)聚合物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-高分子科學(xué)系 上海 200433;3 上海女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200011)

宮頸癌是一種常見(jiàn)的女性惡性腫瘤,晚期和復(fù)發(fā)性宮頸癌是致命的,常常需要化療和放療。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一種被廣泛使用的化療藥,用于治療各種不同類型的惡性腫瘤,包括晚期卵巢癌、宮頸癌、肺癌和其他惡性腫瘤[1-2]。因?yàn)槿狈μ禺惖哪[瘤靶向性,紫杉醇不僅作用于腫瘤細(xì)胞,同時(shí)也作用于正常細(xì)胞。因此,伴隨著PTX的使用,其毒性作用及不良反應(yīng)也總是一并出現(xiàn),如心血管毒性、過(guò)敏和神經(jīng)毒性等。另外,PTX還有個(gè)很重要的缺點(diǎn),即低水溶性。為改善其水溶性,PTX復(fù)合溶液中添加了某些助溶劑,但這又進(jìn)一步增加了助溶劑本身帶來(lái)的不良反應(yīng)。

為減少PTX的不良反應(yīng)、拓廣PTX的應(yīng)用,科學(xué)家們研究了許多更為安全的藥物載體[1,3]。介孔二氧化硅納米粒(mesoporous silica nanoparticles,MSN)于20世紀(jì)90年代[4]被首次提出,與傳統(tǒng)載體相比,具有高度有序、高比表面積、良好生物相容性、易修飾性、無(wú)生理毒性等優(yōu)勢(shì),其作為藥物釋放系統(tǒng)的潛能相繼得到特殊關(guān)注[5-8]。然而,如果單純將PTX包裹于MSNs內(nèi),不增加“釋藥閥門”,一旦進(jìn)入體內(nèi),攜帶的藥物尚未到達(dá)病灶部位,就會(huì)被快速釋放和清除,致其不能發(fā)揮改善藥物生物利用度的作用[9-10]。

我們先前的研究已經(jīng)構(gòu)建了一個(gè)以二硫鍵共價(jià)鏈接PTX的MSN[11-13],并對(duì)其釋藥性能做了初步評(píng)估。從材料學(xué)分類來(lái)講,二硫鍵復(fù)合納米粒屬于刺激響應(yīng)型聚合物,即能識(shí)別體內(nèi)微環(huán)境,對(duì)刺激進(jìn)行動(dòng)態(tài)反應(yīng)。二硫鍵在谷胱甘肽(glutathione,GSH)作用下,發(fā)生氧化還原反應(yīng),能快速裂解,從而獲得氧化還原刺激響應(yīng)。研究表明,腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的濃度異常高于血漿(1～10 mmol/Lvs.1～2 μmol/L[14]),因此二硫鍵在輕微氧化環(huán)境如細(xì)胞外環(huán)境和血漿中十分穩(wěn)定。利用二硫鍵負(fù)載藥物的方式,可以選擇性地將藥物釋放于細(xì)胞內(nèi),而不是血漿中,以此增強(qiáng)藥物作用的靶向性,并減小非靶向部位的毒性作用及不良反應(yīng)。為對(duì)其載藥性能及抗腫瘤效果做全面評(píng)估,本文進(jìn)行了一系列體內(nèi)和體外研究。

材 料 和 方 法

主要試劑與材料PTX購(gòu)自北京中化科技有限公司,純度≥98%。青霉素/鏈霉素雙抗溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)?？寺?shí)驗(yàn)室。胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibico公司。異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)購(gòu)自日本東京仁成工業(yè)株式會(huì)社。原硅酸四乙酯(Tetraethyl orthosilicate,TEOS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APS)、N-溴化十六烷基三甲銨(N-cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)和三甲基苯(mesitylene,TMB)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。Tunel檢測(cè)試劑購(gòu)于瑞士羅氏公司。蘇木精-伊紅染色試劑購(gòu)于珠海貝索(Baso)生物技術(shù)有限公司。負(fù)載紫杉醇的熒光介孔二氧化硅納米粒(Paclitaxel-loaded fluorescent mesoporous silica nanoparticles,PTX-FMSN)合成過(guò)程詳見(jiàn)于本課題組之前的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[11-12]。

細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)贈(zèng)送。細(xì)胞放入培養(yǎng)基中培育,同時(shí)加入10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)箱在充分濕化的5% CO2空氣中維持37 ℃恒溫。用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)將HeLa細(xì)胞接種于48孔培養(yǎng)皿中,每孔細(xì)胞密度2.4×105,37 ℃孵育24 h,接著放入不同濃度的PTX-FMSN (分別為0.01、0.1、1和5 μg/mL),利用Cell-IQ活細(xì)胞工作站連續(xù)觀察60 h,分析總細(xì)胞數(shù),穩(wěn)定態(tài)細(xì)胞數(shù),分裂態(tài)細(xì)胞數(shù)及死亡細(xì)胞數(shù),自動(dòng)計(jì)數(shù)計(jì)算得到細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 PTX(濃度分別為0.01、0.1、1和5 μg/mL)和未帶藥FMSN均相同處理。另取3組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞,分別加入0.1 μg/mL的PTX和相同濃度的PTX-FMSN,以空白FMSN作為對(duì)照,37 ℃恒溫孵育,分別于第8、16、24、32、40 h收集細(xì)胞,制成1×106/mL細(xì)胞懸液,PBS液洗2遍。加入5 mL Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide,PI)混勻,室溫、避光反應(yīng)15 min,上流式細(xì)胞儀觀察和檢測(cè)細(xì)胞,各組重復(fù)3次。

宮頸癌動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)用4～6周大雌性裸鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),飼養(yǎng)于南方模式生物SPF動(dòng)物房,動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境、模型構(gòu)建和取材過(guò)程均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》(科技部2006年9月13日)。0.2 mL內(nèi)含有1×107個(gè)HeLa細(xì)胞的溶液經(jīng)皮下注入裸鼠右側(cè)腋下。3天后,可見(jiàn)瘤體形成。

體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。裸鼠按實(shí)驗(yàn)方案分為4組,每組4只(表1)。成瘤方法如上所述。瘤體長(zhǎng)到約100 mm3時(shí),裸鼠按組分別經(jīng)尾靜脈注入生理鹽水、PTX溶液、未帶藥FMSNs、PTX-FMSNs,每3天重復(fù)給藥1次,藥物濃度分別為4、8、12 mg/kg,同時(shí)用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑,按照以下公式測(cè)算腫瘤大小:腫瘤體積=1/2×腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑。注入腫瘤細(xì)胞后21天,經(jīng)全身生物發(fā)光成像后,以水合氯醛(濃度4%,劑量0.20 mL/20 g)鎮(zhèn)靜,1.5%異氟烷吸入麻醉,自裸鼠腹部正中線向上剖開,自下向上剪至劍突,沿兩側(cè)肋弓V字型打開胸廓,血管鉗夾持左側(cè)胸壁翻轉(zhuǎn),暴露心臟,以康德萊1 mL注射器刺入右心室,取靜脈血,注入EDTA抗凝管中。自裸鼠體內(nèi)取出瘤體、肺、肝、小腸、胃、心臟和腎,經(jīng)4%甲醛溶液固定,制成石蠟塊。

全身生物發(fā)光成像本實(shí)驗(yàn)采用全身生物發(fā)光成像監(jiān)測(cè)藥物分布。經(jīng)尾靜脈注入藥物后15 min,裸鼠經(jīng)1.5%異氟烷麻醉后成像。

組織染色用TUNEL法進(jìn)行腫瘤組織染色[15]。肺、肝、小腸、胃、心臟和腎組織切片HE染色后,由病理學(xué)專家作出診斷。

表1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)給藥方案Tab 1 Drug delivery protocol in vivo experiment

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用STATA12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。多組間比較用單因素方差分析,兩組間比較用Bonferroni 校正。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

藥物投遞系統(tǒng)的制備PTX-FMSN合成過(guò)程詳見(jiàn)于之前本課題組發(fā)表的論文[11-13]。最終我們得到的FMSNs外觀為規(guī)則的離散球形,平均直徑約147 nm,其內(nèi)部為有序的中空多孔狀結(jié)構(gòu),載藥效率為12%。

體外抗腫瘤評(píng)價(jià)圖1顯示的是在不同濃度藥物和培育時(shí)間下的HeLa細(xì)胞活性。從圖1A和1B可知,細(xì)胞活性與藥物濃度密切相關(guān),PTX溶液抑制細(xì)胞活性的作用稍強(qiáng)于PTX-FMSN。當(dāng)藥物濃度在0.1 μg/mL時(shí),PTX-FMSN和PTX在抑制HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)細(xì)胞死亡上無(wú)差異,提示PTX-FMSN能很好地釋放藥物。當(dāng)藥物濃度為0.01 μg/mL時(shí),PTX-FMSN對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和殺傷作用較PTX稍弱,可能是因?yàn)樗幬餄舛鹊?釋放量較少。

A:Cell viability of HeLa cells incubated with PTX and PTX-FMSN at different concentrations of drugs for 60 h.B:Cell viability of HeLa cells with different incubation time at 0.1 μg/mL of drug concentration.The cells treated with blank FMSN were used as a control.(1)vs.Control,P<0.05.

圖1 經(jīng)PTX和PTX-FMSN處理的HeLa細(xì)胞活性
Fig 1 Cell viability of HeLa cells with PTX and PTX-FMSN

為了進(jìn)一步評(píng)估PTX-FMSN的抗腫瘤效應(yīng),我們通過(guò)Annexin V-FITC/PI試劑,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡和壞死率。圖2顯示PTX和PTX-FMSN不同作用時(shí)間下,HeLa細(xì)胞的凋亡和壞死情況。結(jié)果表明,雖然細(xì)胞死亡率在PTX-FMSN組相對(duì)稍低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PTX和PTX-FMSN作用下的HeLa細(xì)胞凋亡和壞死率趨勢(shì)一致。根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,PTX-FMSN與PTX對(duì)HeLa細(xì)胞有相似的抑制作用。

A:HeLa cells counts at 16 h,24 h,32 h and 40 h.B:Apoptosis rate (left) and necrosis rate (right) of HeLa cells.The cells treated with blank FMSN were used as a control.The concentration of drug was 0.1 μg/mL.(1)vs.Control,P<0.05.

圖2 經(jīng)PTX和PTX-FMSN處理的HeLa細(xì)胞凋亡壞死情況
Fig 2 The apoptosis and necrosis of HeLa cells treated with PTX and PTX-FMS

體內(nèi)抗腫瘤評(píng)價(jià)因?yàn)榧{米復(fù)合物在合成過(guò)程中添加了熒光分子FITC,可以通過(guò)發(fā)光成像觀察PTX-FMSN在體內(nèi)的分布。從圖3A可以看出,裸鼠注射空白FMSN作為對(duì)照組,在其身上未發(fā)現(xiàn)集中的熒光信號(hào)。而PTX-FMSNs通過(guò)尾靜脈注入裸鼠4 h后,腫瘤部位即顯示強(qiáng)烈熒光,表明PTX-FMSN能高效富集于腫瘤部位。

在裸鼠成瘤給藥后21天,所有的實(shí)驗(yàn)裸鼠在麻醉下處死。腫瘤的生長(zhǎng)曲線顯示(圖3B),未帶藥的FMSNs組與生理鹽水組相似,對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。PTX溶液組和PTX-FMSN組顯示明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果,其效果隨著藥物濃度增加而增強(qiáng),在腫瘤生長(zhǎng)抑制效果上,PTX-FMSN和PTX兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A:The whole-body bioluminescence imaging of tumor-bearing mice after blank FMSN (left) and PTX-FMSN (right) administration for 4 h.B:The growth curves of tumors treated with different drug doses.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖3 裸鼠熒光成像和腫瘤生長(zhǎng)曲線
Fig 3 Bioluminescence imaging and the growth curves of tumors in nude mice

為了進(jìn)一步研究納米復(fù)合物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用,本研究將腫瘤組織制成病理切片。TUNEL染色后,腫瘤中的壞死組織在光學(xué)顯微鏡下顯示為淺棕色。從圖4A-H中可以看出,不考慮藥物濃度因素,PTX和PTX-FMSN兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在低濃度藥物作用下,PTX和PTX-FMSN組和對(duì)照組(生理鹽水和未帶藥FMSN)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)藥物濃度增加(8和12 mg/kg),PTX和PTX-FMSN組有大量的癌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果也與圖3 B的結(jié)果一致,充分表明PTX-FMSN能在腫瘤部位充分釋放PTX,發(fā)揮出與同等劑量游離PTX相同的抗腫瘤效果。

Tumor tissue necrosis stained by TUNEL (×200).A:Untreated mice (saline);B:Untreated mice (blank FMSNs);C:PTX treated mice at 4 mg/mL concentration;D:PTX-FMSN treated mice at 4 mg/mL concentration;E:PTX treated mice at 8 mg/mL concentration;F:PTX-FMSN treated mice at 8 mg/mL concentration;G:PTX treated mice at 12 mg/mL concentration;H:PTX-FMSN treated mice at 12 mg/mL concentration;I:Comparison of tumor tissue necrosis rates.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖4 裸鼠宮頸癌標(biāo)本病理切片(TUNEL染色)
Fig 4 Pathological section of cervical cancer speciments in nude mice (stained by TUNEL)

體內(nèi)藥物不良反應(yīng)首先,本研究檢查了4個(gè)血常規(guī)指標(biāo),包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù),兩個(gè)對(duì)照組4個(gè)血指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)(圖5)。當(dāng)藥物濃度為8 mg/kg時(shí),所有指數(shù)均是正常的。當(dāng)藥物濃度為12 mg/mL時(shí),PTX組血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著下降,而PTX-FMSN組血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞僅略有下降,這表明隨著藥物濃度升高,PTX-FMSN對(duì)血液毒性低于PTX。

A:White blood cell count;B:Neutrophils count;C:Red blood cell count;D:Platelet count.(1)P<0.05.

圖5 不同藥物處理的小鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)
Fig 5 Blood cells counts in mice treated by different drugs

隨后,本研究將裸鼠的臟器制成切片,通過(guò)組織學(xué)檢查觀察有無(wú)病理變化。結(jié)果如圖6及表2所示,PTX和PTX-FMSN兩組在低藥物濃度時(shí),對(duì)肝、肺和小腸組織損傷程度的差異不顯著,但隨著藥物濃度的增加,PTX組對(duì)上述臟器組織的損傷程度明顯大于PTX-FMSN組。

討 論

MSNs是具有均勻可調(diào)節(jié)孔徑的中空立體載物體,可在2～50 nm范圍內(nèi)任意調(diào)整孔徑大小,具有穩(wěn)定的骨骼結(jié)構(gòu)、較高的表面積和載藥率,并且微粒本身無(wú)生理毒性,非常適合攜帶藥物。此外,MSNs的內(nèi)部和外部表面有大量的活性硅氧基,可以被不同的功能基團(tuán)或功能聚合物改性。納米技術(shù)有望能改善藥物的生物利用率,減小藥物毒性作用及不良反應(yīng),并提高藥物水溶性。因此,在藥物載體的研發(fā)中,MSNs受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

YU等[16]報(bào)道的PTX納米復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,因減少了從腎小管的濾除,從而增加了血循環(huán)留存時(shí)間,并利用納米顆粒的高滲透長(zhǎng)滯留效應(yīng),在腫瘤部位有較好的聚集性,PTX納米復(fù)合物聯(lián)合放療與單純PTX或單純放療相比,對(duì)宮頸癌具有更好的抗腫瘤效果,其抑制腫瘤增生的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Ki-67,降低微血管密度、CD31和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子實(shí)現(xiàn)的,一定程度上增加了放化療敏感性。

A:Lung;B:Liver;C:Small intestinal villi.HE stain (×200).

圖6 各組小鼠肺、肝和小腸組織改變的染色結(jié)果Fig 6 Histology stain of lung,liver and small intestinal villi changes in different mice groups

根據(jù)腫瘤組織中表達(dá)的特殊抗原或配體,可以制作相匹配的MSNs藥物靶向復(fù)合體,以提高抗腫瘤藥物作用的靶向性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗腫瘤藥物納米復(fù)合物在腫瘤組織中具有良好的聚集性,從而發(fā)揮了更高效的抗腫瘤作用[17-19]。研究報(bào)道[17,20],因腫瘤細(xì)胞具有高速代謝特點(diǎn),其表面較正常細(xì)胞配備更多葉酸受體,故含有葉酸配體的納米復(fù)合物可用于腫瘤靶向治療,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)此類納米復(fù)合物發(fā)揮了良好的抗腫瘤效果,且減小了藥物的毒性作用及不良反應(yīng)。

另有研究表明,在腫瘤細(xì)胞中谷胱甘肽的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常[21],二硫鍵可以在谷胱甘肽的作用下分離,通過(guò)二硫鍵共價(jià)聯(lián)合抗腫瘤藥物和納米顆粒的應(yīng)用已有報(bào)道[22]。Luo等[23]通過(guò)二硫鍵將PTX鏈接于納米顆粒上,然后對(duì)荷瘤小鼠(人表皮癌)給予相當(dāng)于8 mg/kg劑量的PTX治療,結(jié)果提示PTX納米復(fù)合物與單純PTX相比,前者的腫瘤聚集性更加明顯,在其他臟器的積聚更少。在觀察終末,經(jīng)PTX納米復(fù)合物治療的負(fù)荷小鼠,腫瘤完全消退。但此類納米復(fù)合物用于治療宮頸癌的相關(guān)報(bào)道甚少,尤其是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的資料匱乏。

在本研究中,課題組通過(guò)二硫鍵共價(jià)鏈接合成PTX-FMSN復(fù)合物。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,PTX-FMSN顯示出與PTX相似的對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制和促凋亡作用。空白FMSN作為細(xì)胞試驗(yàn)對(duì)照組,結(jié)果顯示對(duì)細(xì)胞活性基本無(wú)影響,這也說(shuō)明FMSN作為藥物載體是安全的。

通過(guò)全身生物熒光成像,表明PTX-FMSN具有較好的腫瘤靶向性。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)PTX溶液和PTX-FMSN處理的裸鼠,其腫瘤生長(zhǎng)曲線無(wú)顯著差異,兩組的細(xì)胞壞死率也無(wú)顯著差異。血液檢測(cè)結(jié)果表明,PTX-FMSN組中血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于PTX組。通過(guò)病理評(píng)估,可以看到PTX和PTX-FMSN治療組裸鼠肺、肝、小腸有組織學(xué)變化,但同劑量下的PTX組病變較PTX-FMSN組更為嚴(yán)重。

本研究通過(guò)上述一系列體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn),提示PTX-FMSN對(duì)宮頸癌有抑制作用,其效果與單純PTX相當(dāng);通過(guò)二硫鍵共價(jià)鏈接,使PTX充分釋放在腫瘤組織內(nèi),同時(shí)減小了藥物對(duì)其他臟器的毒性作用及不良反應(yīng)。這些結(jié)果與Luo等[23]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合,進(jìn)一步驗(yàn)證了二硫鍵這一閥門在控制藥物釋放中是安全有效的,其對(duì)于宮頸癌的治療前景值得肯定。當(dāng)然,我們的實(shí)驗(yàn)尚不完善,需進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),比如增加藥代學(xué)方面的研究。對(duì)PTX復(fù)合物的設(shè)計(jì)也可進(jìn)一步完善,如增加其他抗腫瘤藥物研究聯(lián)合抗癌效應(yīng),增加靶向標(biāo)記讓其更具腫瘤靶向性等。我們也可以嘗試在其他腫瘤中做相應(yīng)的抗癌評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn),這些都有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去考證。