唐天才，劉城成，袁東波，郭 莉，侯 巍，莫 茜，陽愛國，郝力力，*，李 銳

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041； 2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都，610041；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州310021)

巴爾通體(Bartonella)是一類廣泛寄生于脊椎動物紅細胞內(nèi)的革蘭氏陰性菌，可引起嚴重的人獸共患病，如人類卡里翁病(Carion’s disease)、戰(zhàn)壕熱(trench fever)、貓爪病(cat-sratch disease，CSD)等[1]，是近年來我國新發(fā)傳染病之一，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。巴爾通體可廣泛存在于自然界的動物體內(nèi)，包括犬、貓、兔、牛、鼠，及一些野生動物等，并經(jīng)蜱、蚤、白蛉等吸血節(jié)肢動物傳播。近年來，國內(nèi)外對人、嚙齒動物，以及蜱巴爾通體感染情況進行了相關(guān)調(diào)查。美國、法國、秘魯、荷蘭采用PCR方法對蜱、蚤體內(nèi)巴爾通體進行了檢測[2-3]；意大利、日本、菲律賓等國家對貓巴爾通體感染情況進行了調(diào)查[4]；福建[5]、浙江[6]、黑龍江[7]、云南[8]等省區(qū)對蜱、鼠形動物的巴爾通體感染情況進行了一系列調(diào)查。石渠縣位于四川西北部的純牧業(yè)縣，境內(nèi)平均海拔4 200 m，牦牛是當?shù)刈钪匾蛿?shù)量最多的家畜，整體養(yǎng)殖方式粗放，驅(qū)蟲意識淡薄，更重要的是牧民與牦牛接觸極其緊密，極易被寄生于牦牛體表的蜱叮咬繼而感染相關(guān)蜱媒病。到目前為止，尚無石渠縣境內(nèi)巴爾通體的相關(guān)報道。因此，本研究以石渠縣牦牛體表的蜱為研究對象開展調(diào)查，以期初步了解當?shù)仃笈ｓw表寄生蜱的種類及其巴爾通體的感染情況，為該地區(qū)蜱傳巴爾通體病的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蜱采集

于2018年3至8月從石渠縣麻甲鄉(xiāng)、德榮馬鄉(xiāng)、阿日扎鄉(xiāng)和長須干瑪鄉(xiāng)的牦牛體表采集蜱(每個鄉(xiāng)選擇2～3個村，每村選擇2～3家農(nóng)戶的牦牛群，每頭牦牛體表采集5～6只，此法采集相對更能保證樣本的代表性和真實性)，裝入收集管，塞入潮濕脫脂棉，形態(tài)分類后放入75%乙醇溶液中，并置于4 ℃冰箱保存待檢。

1.1.2 主要試劑

組織基因組DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit)；Trans 2K Plus DNA marker、2× EasyTaqPCR SuperMix(北京全式金公司)，1×TAE溶液，瓊脂糖。引物合成、測序均由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(成都公司)完成。

1.1.3 主要器材

電泳儀電源(北京六一儀器廠，DYY-6C型)、Leica S9D體視顯微鏡、臺式高速離心機(eppendorf 5402型)、Bio-Rad伯樂梯度PCR擴增儀(PTC240型)和Bertin Precellys 24研磨器等。

1.2 方法

1.2.1 蜱形態(tài)分類

根據(jù)文獻[9]和[10]，采用體視顯微鏡對蜱初步進行形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定后選取每個地點不同種類蜱的20%進行分子生物學(xué)鑒定，最終確定種類。

1.2.2 DNA提取

取出用75%乙醇保存的樣品，無菌水洗滌晾干后沿縱向中軸線切割，分別裝入EP管，半只于-80 ℃冰箱凍存，另外半只加入500 μL無菌水于Bertin Precellys 24研磨器充分研磨，參數(shù)如下：每管加入陶瓷珠(直徑0.5 mm的20珠和2 mm的5珠)，5 500g研磨2次；4 000g研磨1次。取研磨液200 μL，用EasyPure Genomic DNA Kit按照說明書提取DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR檢測

蜱和巴爾通體的分子鑒定分別采用Ondrejicka等[11]和Reis等[12]建立的方法，引物見表1。2種引物擴增均采用25 μL的反應(yīng)體系：2× EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，模板1 μL、ddH2O 9.5 μL，混勻。設(shè)陽性對照(B.melophagiDNA由本實驗室保存)和陰性對照(去離子水)。蜱COⅠ基因擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸55 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫。巴爾通體gltA基因擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸8 min；16 ℃保溫。取2 μL PCR擴增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中100 V電泳30 min，凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

1.2.4 序列分析和統(tǒng)計分析

陽性樣品送生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(成都公司)測序，所得序列用DNA Star軟件進行拼接分析，在NCBI中BLAST進行比對，再應(yīng)用MEGA 6.0軟件以Neighbor-Joining法(bootstrap值1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜱采集數(shù)量與形態(tài)鑒定

4個鄉(xiāng)共采集到蜱818只，分別是長須干瑪鄉(xiāng)234只、麻甲鄉(xiāng)224只、德榮瑪鄉(xiāng)192只、阿日扎鄉(xiāng)168只。經(jīng)鑒定，青海血蜱172只，西藏革蜱646只，形態(tài)特征分別如圖1、圖2所示。

2.2 蜱分子鑒定

2.2.1 蜱COⅠ基因擴增

表1 PCR引物

Table 1 PCR primers

鑒定物種Species引物序列Primer sequence(5'-3')靶基因Gene產(chǎn)物大小Product/bp參考文獻References蜱TickLCO1490: GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGCOⅠ658[11]HCO2198: TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA巴爾通體Bart781: GGGGACCAGCTCATGGTGGgltA356[12]Bartonella sppBart1137: AATGCAAAAAGAACAGTAAACA

A，青海血蜱背面；B，青海血蜱腹面。A， Dorsal surface of Haemaphysalis qinghaiensis; B， Ventral surface of Haemaphysalis qinghaiensisi.圖1 青海血蜱形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Haemaphysalis qinghaiensis

A，西藏革蜱背面；B，西藏革蜱腹面。A， Dorsal surface of Dermacentor everestianus; B， Ventral surface of Dermacentor everestianus.圖2 西藏革蜱形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Dermacentor everestianus

以提取的蜱組織DNA為模板，擴增蜱COⅠ基因片段，均出現(xiàn)目的條帶，部分樣本電泳如圖3所示，片段大小約658 bp，與預(yù)期相符。

2.2.2 蜱COⅠ基因遺傳進化分析

蜱COⅠ基因序列經(jīng)拼接、比對后共得5條，其中4條屬于西藏革蜱，1條屬于青海血蜱，分別命名為D.everestianus. shiqu1-4、H.qinghaiensis. shiqu。選取Blast比對后同源性最高的序列1～2條以確定種，即青海血蜱和西藏革蜱，再選取不同地點分離到的青海血蜱和西藏革蜱的COⅠ序列，最后選取部分不同種類的血蜱和革蜱的COⅠ序列作為參考序列，構(gòu)建進化樹。如圖4所示，4個革蜱分離株和西藏革蜱(KJ396938)親緣關(guān)系最近，同源性達98.0%～99.5%。血蜱分離株則與甘肅天祝(MF981066)、甘肅臨洮(MF981034)分離的青海血蜱親緣關(guān)系最近，同源性達99.09%；與青海湟源(MF981069)、甘肅永靖(MF982056)分離的青海血蜱同源性分別達98.63%、98.48%。

2.3 巴爾通體gltA基因PCR擴增

以提取的蜱組織DNA為模板，擴增巴爾通體gltA基因片段，麻甲鄉(xiāng)部分樣本電泳如圖5所示，片段大小約356 bp，與預(yù)期相符。

2.4 巴爾通體PCR檢測結(jié)果

巴爾通體檢測結(jié)果如表2所示，在818只蜱中，有246只檢測到巴爾通體，感染率為30.07%(246/818)。其中，麻甲鄉(xiāng)感染率最高，達76.79%，其余依次是長須干瑪鄉(xiāng)17.95%、德榮瑪鄉(xiāng)12.50%、阿日扎鄉(xiāng)4.76%。經(jīng)χ2檢驗，麻甲鄉(xiāng)的感染率顯著(P<0.05)高于其他3個地方。另外，只在麻甲鄉(xiāng)采集到2種蜱。

M，DL 2 000 marker；1，陽性對照；2～8，蜱樣本；9，陰性對照。M， DL 2 000 marker; 1， Positive control; 2-8， Tick samples; 9， Negative control.圖3 麻甲鄉(xiāng)部分蜱COⅠ基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR products of COⅠ gene of tick samples

圖4 基于COⅠ基因蜱種系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of ticks based on COⅠ gene

M，DL 2 000 marker；1，陽性對照；2～9，蜱樣本；10，陰性對照。M， DL 2 000 marker; 1， Positive control; 2-9， Tick samples; 10， Negative control.圖5 麻甲鄉(xiāng)部分巴爾通體gltA基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 PCR products of gltA gene of some samples in Maga village

2.5 巴爾通體gltA基因遺傳進化分析

巴爾通體gltA基因序列拼接、比對后共得3條，分別命名為UnculturedBartonellasp. Shiqu 1-3，其中UnculturedBartonellasp. shiqu1與unculturedBartonellasp.shiqu 2僅1個堿基的差異，與UnculturedBartonellasp. shiqu 3有34個堿基的差異。選取Blast比對后同源性最高的序列1～2條，以及不同種類巴爾通體的gltA基因序列等16條作為參考序列，構(gòu)建進化樹，進行種系發(fā)育關(guān)系分析。如圖6所示，UnculturedBartonellasp. shiqu1和UnculturedBartonellasp. shiqu 2與美國的Bartonellamelophagi(AY724768)序列同源性分別達100%和99.7%，與我國新疆未定種的UnculturedBartonellasp.xinjiang (KY224150)同源性分別達100%和99.7%。UnculturedBartonellasp. shiqu 3與未定種的Bartonellasp. RF124HAIN(FJ464240)序列最接近，同源性達98%，與臺灣分離的Bartonellagrahamii(GU056195)同源性達95%。

表2 石渠縣蜱巴爾通體PCR檢測結(jié)果

Table 2 Detection results of ticks-borneBartonellain Shiqu County

調(diào)查點Location樣本數(shù)Number of samples青海血蜱H. qinghaien-sis西藏革蜱D. everestianus合計Total陽性數(shù)Number of postive samples青海血蜱H. qinghaien-sis西藏革蜱D. everestianus合計Total感染率Infection rate/%青海血蜱H. qinghaien-sis西藏革蜱D. everestia-nus合計Total阿日扎Arizha016816808804.764.76麻甲Maga172522241363617279.0769.2376.79*德榮瑪019219202424012.5012.50Derongma長須干瑪023423404242017.9517.95Changxugan-ma 合計Total17264681813611024679.07*17.0330.07

*表示差異顯著(P<0.05)。

* represented the significant difference(P<0.05).

圖6 基于gltA基因巴爾通體系統(tǒng)進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree of Bartonella based on the gltA gene

3 討論

蜱的發(fā)育過程分卵、幼蜱、若蜱、成蜱4個時期，屬不完全變態(tài)發(fā)育，在每個時期形態(tài)特征不同，而相近物種之間形態(tài)特征又相似，所以僅從形態(tài)學(xué)鑒定需要豐富的經(jīng)驗，難度較大。目前，COⅠ基因是DNA條形碼基因之一，能夠在種的水平對物種進行鑒定[11，13]。因此，形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法已廣泛應(yīng)用于蜱的鑒定，如Casati等[14]通過COⅠ基因鑒別了澳大利亞的具角硬蜱與全環(huán)硬蜱，呂繼洲等[15]通過COⅠ基因鑒定了新疆的草原革蜱和邊緣革蜱。本研究鑒定出2種蜱，即青海血蜱和西藏革蜱，這可能與采集方法和宿主有關(guān)，原因包括：1)蜱生活史中90%以上處于非寄生階段，多棲息于草原、森林等生境；2)單宿主蜱發(fā)育階段均在一個宿主體表，如微小牛蜱；3)二宿主和三宿主蜱每一發(fā)育階段飽血后均脫落，下一階段重新尋找宿主[16]，如青海血蜱、西藏革蜱。本試驗僅從牦牛體表采集，后期可采用布旗法或者加大宿主種類，從馬、高原鼠兔、高原鼢鼠等體表采集，從而更系統(tǒng)、更全面、更深入的研究石渠縣蜱的種類和分布。此外，青海血蜱只在麻甲鄉(xiāng)采集到，這可能與蜱的生活特性、海拔有關(guān)。每種蜱都有特定的生存環(huán)境，包括海拔、植被類型等，如西藏革蜱僅生存于3 500～4 500 m的高海拔地區(qū)，而青海血蜱分布在海拔2 000～4 200 m的地區(qū)[16]。就地理位置而言，麻甲鄉(xiāng)位于金沙江河谷寒溫帶半農(nóng)牧區(qū)，海拔在3 300～3 800 m，而其他3個鄉(xiāng)位于雅礱江流域亞寒帶純牧區(qū)，海拔在4 300～4 600 m，兩區(qū)的海拔高度存在明顯的差異，這很可能是只在麻甲鄉(xiāng)發(fā)現(xiàn)青海血蜱的主要原因。

巴爾通體是一種地理分布廣泛，宿主動物種類繁多，可通過蜱、蚤等節(jié)肢動物傳播的人獸共患病原體。gltA基因為巴爾通體的遺傳學(xué)分類標志[6]，在國內(nèi)外已被廣泛應(yīng)用于巴爾通體的診斷和研究。如美國[2]、荷蘭[3]等均有報道從太平洋硬蜱(Ixodespacificus)和篦子硬蜱(Ixodesricinus)等蜱中擴增出巴爾通體的gltA基因，其感染率分別為19.2%(29/151)和60.0%(73/121)；孫繼民等[6]從浙江省中華硬蜱中擴增出巴爾通體的gltA基因，其感染率為16.3%(14/86)。本試驗共采集到818只蜱，其中有246只檢測到巴爾通體，感染率為30.07%。值得注意的是，只有在麻甲鄉(xiāng)采集到2種蜱，且青海血蜱的感染率(79.07%)高于西藏革蜱(69.23%)，其主要原因可能是蜱的種類不同。據(jù)報道，某些蜱是一些特定病原的攜帶者，如青海血蜱是羊泰勒蟲的主要傳播媒介[17]；網(wǎng)紋革蜱(D.reticulatus)更容易攜帶勞氏立克次體，而邊緣革蜱(D.marginatus)更容易感染斯洛伐克立克次體[18]。本試驗中，相對于西藏革蜱而言，青海血蜱是否為攜帶巴爾通體的優(yōu)勢蜱還需進一步研究。另外，不同地點的感染率存在差異(P<0.05)，其中，麻甲鄉(xiāng)的總感染率為76.79%，顯著高于其他3個地方，這可能與麻甲鄉(xiāng)相對較低的海拔和舒適的氣候有關(guān)。

至今證實有B.grahamii、B.melophagi、B.henselae、B.elizabethae等15種巴爾通體可導(dǎo)致人類疾病[19]。有報道從人的血液中通過PCR方法檢測到B.melophagi[20]，同樣也從以色列的牛血中檢測到B.melophagi[21]。鑒于此，后期可擴大調(diào)查對象，對牦牛血進行檢測，從而深入了解石渠縣巴爾通體的流行情況。遺傳進化分析顯示，本試驗中共檢測到2種巴爾通體，一種與B.melophagi親緣關(guān)系最近，另一種則與未定種的Bartonellaspp. RF124HAIN和B.grahamii遺傳關(guān)系最接近。

綜上所述，本試驗首次對石渠縣牦牛源蜱中巴爾通體的感染情況進行了調(diào)查，蜱較高的感染率提示當?shù)鼐用翊嬖诟腥景蜖柾w的風(fēng)險，后期應(yīng)進一步加強巴爾通體流行情況的監(jiān)測，為當?shù)匕蜖柾w的研究和防控提供數(shù)據(jù)支持。