吳 雨，宋汝謀，陳 偉，楊忠誠，盧賢君，黃明捷，陳 祥*

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.安順市畜牧技術推廣站，貴州安順 561000；4.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州貴陽 550025）

動物的生長發(fā)育受許多因素影響，而這些因素都直接或間接受促生長激素軸的調控[1]。動物的促生長激素軸主要包括生長激素釋放因子、生長激素和胰島素生長因子[2]，其中生長激素（Growth Hormone，GH）是促生長激素軸的核心組成部分，對動物的生長發(fā)育起決定作用。GH 是一種單鏈多肽激素，由垂體前葉分泌，是一種生長調節(jié)類激素[3-5]。Vasilatos-younken 等[6]研究表明，GH 與其受體結合后能刺激局部組織產(chǎn)生胰島素生長因子來調節(jié)骨骼肌的生長發(fā)育。進一步研究表明，GH 基因多態(tài)位點能夠顯著影響牛的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能。谷朝勇[7]研究發(fā)現(xiàn)，魯西黃牛GH 基因2 639 bp處存在堿基C→G 突變，相關分析得到等位基因B 是影響牛體尺性狀的優(yōu)勢基因。張超等[8]研究發(fā)現(xiàn)，中國西門塔爾牛GH 基因的突變BB 基因型屠宰性能指標顯著高于其他基因型，表明BB 基因型對西門塔爾牛生長發(fā)育有利。張艷麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)，早勝牛GH 基因第2、5 外顯子突變的BB 和CD 基因型對其生長階段的體重影響均顯著高于其他基因型。綜上，GH 基因在其他地方品種牛上已有相關研究并取得了一些成果，但其在貴州地方黃牛上未見相關報道。關嶺牛、思南牛、威寧牛、黎平牛屬于貴州優(yōu)良地方品種，其中的關嶺牛早在1982 年就被錄入《中國畜禽品種志》，是“中國五大名?！敝籟10]。關嶺牛、思南牛、威寧牛、黎平牛均含有人體必需的8 種氨基酸，其肉制品蛋白質含量高，脂肪含量較低，深受人們喜愛[11]。但以上品種牛存在體格偏小、生長速度緩慢等問題，在一定程度上影響其發(fā)展[12]。故本實驗以威寧牛、黎平牛、思南牛、關嶺牛為研究對象，以影響生長性狀的GH 基因為候選基因，篩選多態(tài)位點，為后期探究GH 基因對貴州地方黃牛生長性狀的影響機制提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 牛血樣分別采自貴州省關嶺縣、思南縣、威寧縣、黎平縣，其中關嶺牛82 頭、思南和威寧各50 頭、黎平32 頭（共214 頭，年齡均為2 歲）。頸靜脈采血，存于抗凝管中，置-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑 DM2000 DNAMarker、核酸染料、2Es Taq Master Mix（鼎國生物工程技術有限公司）；血液基因組提取試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）；雙蒸水、TAE 緩沖液（實驗室自備）。

1.3 血液基因組DNA 提取 采用血液基因組提取試劑盒對樣品基因組DNA 進行抽提，微量紫外分光光度計檢測其濃度及OD 值，用濃度為1%的瓊脂糖凝膠檢測其完整性。

1.4 引物設計及PCR 擴增 采用NCBI 數(shù)據(jù)庫中牛GH基因的參考序列（GenBank 登錄號：NC_037346），用Premier 5.0 對牛GH 基因第1、2、3、4、5 外顯子設計特異性引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。PCR 體系為20 μL：2×Es Taq Master Mix 10 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物各1.5 μL（10 pmol/μL），ddH2O 5 μL。PCR 反應程序：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸30 s，72℃終延伸5 min，35 個循環(huán)。

表 1 引物序列

1.5 篩選多態(tài)性位點 采用DNA 混池方法將214 頭牛種血樣DNA 每份取1 μL 進行混合，混合后的總DNA取1 μL 作為模板進行PCR 擴增送到上海生工生物工程股份有限公司進行單向測序，應用DNAStar 軟件中SeqMan Ⅱ程序對測序峰圖進行分析比對，并與NCBI 上發(fā)布的序列進行對比分析，篩選貴州地方黃牛SNPs 位點。

1.6 等位基因頻率估算 應用MWSnap 軟件測量各SNPs 位點等位基因峰高。并應用公式fi= hi/（h1+h2）（i=1，2）來估算等位基因頻率。其中，fi 為SNP 位點某等位基因的頻率；h1、h2 分別表示測序圖上等位基因1、2 的峰高。

1.7 生物信息學分析 訪問ExPASy 服務器（http://us.expasy.org/tools/protparam.html）分析牛GH 蛋白理化性質，訪問ExPASy 服 務 器（http:www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）提交GH 蛋白的氨基酸序列，對其親水性和疏水性進行分析，用TMHMM 軟件（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測牛GH 蛋白跨膜結構，用SignalP 軟件預測牛GH 蛋白信號肽，用SOPMA 軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預測牛GH 蛋白二級結構。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取結果 用紫外分光光度計檢測血液基因DNA 濃度和純度，用含核酸染料的1% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的條帶明亮無明顯拖尾（圖1），可用于下一步實驗。

圖1 4 個牛種血液基因組DNA 提取檢測結果

2.2 PCR 擴增 如圖2 所示，GH 基因第1、2、3、4、5 外顯子經(jīng)PCR 擴增后分別獲得364、359、382、421、531 bp 的目的片段，每個目的片段無雜帶，特異性較好，可用作下一步測序。

2.3 測序 從4 個牛種（關嶺牛、思南牛、威寧牛、黎平牛）中共檢測出2個SNPs 位點（Exon5-G1570C、Exon5-A1720C），均位于第5 外顯子。再分別混合每一品種牛的總DNA 取1 μL 為模板，對第5 外顯子進行PCR 擴增并分別測序。如圖3 所示，關嶺牛、思南牛、威寧牛中均存在這2 個SNPs 位點，而黎平牛僅存在1 個SNPs 位點（Exon5-A1720C）。

2.4 等位基因頻率估算 從表2 可見，Exon5-G1570C、Exon5-A1720C 均發(fā)生在基因編碼區(qū)，其中Exon5-G1570C 為錯義突變，編碼的纈氨酸突變?yōu)榱涟彼崆以撐稽c基因頻率在3 個牛種（關嶺牛、思南牛、威寧牛）中差別較大，威寧牛等位基因C 頻率明顯低于其他牛種；Exon5-A1720C 為同義突變，編碼的氨基酸并未改變且4 個牛種中均發(fā)現(xiàn)該突變，其中黎平牛等位基因C 頻率明顯低于其他牛種。

2.5 生物信息學分析

圖2 GH 基因PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

圖3 GH 基因PCR 產(chǎn)物測序峰圖及SNP 位點

表2 牛GH 基因SNPs 等位基因頻率估算

2.5.1 GH 基因突變前后的mRNA 二級結構預測 GH基因突變前后的mRNA 二級結構預測結果顯示（圖4），編碼區(qū)突變位點Exon5-G1570C、Exon5-A1720C 均導致mRNA 二級結構發(fā)生改變。Exon5-G1570C 位點：自由能由-109.33 J/mol 變?yōu)?106.48 J/mol，突變后，RNA 自由能升高，穩(wěn)定性降低。Exon5-A1720C 位點：自由能由-109.33J/mol 變?yōu)?110.62 J/mol，突變后，RNA 自由能降低，穩(wěn)定性升高。

圖4 GH 基因G5170C、A1719C 位點突變前后mRNA 二級結構的變化

2.5.2 GH 蛋白理化性質分析 如表3 所示，牛GH 蛋白相對分子質量為27 385.45，理論等電點為6.90，其中Ala、Gln、Gly、Leu、Ser、Thr 氨基酸個數(shù)均超過15，且Leu 所占比列最高，為13.10%；而Asn、Cys、His、Ile、Met、Trp、Tyr 氨基酸個數(shù)均低于10，其中Trp 所占比列最少，為0.80%。

表3 牛GH 蛋白氨基酸含量及所占比例

2.5.3 疏水性分析 由圖5 可知，在第25～70、130～160位這2 個區(qū)域的氨基酸疏水值頻率較密集集中，其中第48 位氨基酸疏水值最大（3.133）；在第60～128、162～243 位這2 個區(qū)域的氨基酸親水值頻率較密集集中，其中第123 位氨基酸親水值最小（-2.767）。綜上可知，整個多肽鏈中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，表明整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性。

圖5 牛GH 蛋白疏水性分析

2.5.4 跨膜區(qū) 如圖6 顯示，牛GH 蛋白所包含的區(qū)域不僅在膜內且跨過膜外，故牛GH 蛋白是跨膜蛋白。

圖6 牛GH 蛋白跨膜區(qū)域分析

2.5.5 信號肽預測 如圖7 所示，表明牛GH 蛋白有信號肽序列，序列為MAAGPRTSLLLAFALLCLPWTQVVGA，推測GH 蛋白可能在跨膜運輸起著信號識別作用，剪切位點位于第53 和第54 位氨基酸之間。

圖7 牛GH 蛋白信號肽預測

2.5.6 二級結構 運用SOPMA 在線軟件預測GH 基因蛋白質二級結構，預測結果可知，GH 蛋白二級結構由4 個結構組成，分別是α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉角及擴展鏈。其中，α-螺旋占53.06%，無規(guī)則卷曲占42.04%，擴展鏈占2.45%，β-轉角占2.45%；其中α-螺旋所占比例分別是無規(guī)則卷曲、擴展鏈、β-轉角的1.3、21.7、21.7 倍；α- 螺旋結構主要集中在第35～44、60～88、120～140、144～152、155～181、206～220、223～234 位 置區(qū)域；無規(guī)則卷曲結構集中在第2～26、45～51、54～59、89～94、100～119、182～189、192～205、 237～244 區(qū)域；擴展鏈結構集中在第96～99 位置區(qū)域；β-轉角結構集中在52～53、96～99 位置區(qū)域。

3 討 論

動物的生長發(fā)育受多種激素調節(jié)，而GH 能夠調節(jié)機體中大部分的脂肪、蛋白質和核酸的代謝[13]。GH主要通過2 種途徑發(fā)揮作用，一是誘導肝臟、肌肉等組織的細胞產(chǎn)生生長激素介質發(fā)揮作用；二是直接作用于靶組織細胞發(fā)揮生理功能[14]。近年來，GH 基因已成為提高動物生產(chǎn)性能、生長速度等方面的研究熱點之一。郝靈慧[15]研究發(fā)現(xiàn)，草原紅牛GH 基因3′UTR 突變位點與其屠宰性狀指標呈顯著相關，且突變位點分型基因BB 基因型為優(yōu)勢基因型。李軍[16]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛GH 基因第5 外顯子2 141 bp 處存在C→G 突變，等位基因G 對生長性能具有正效應。牛志剛等[17]研究發(fā)現(xiàn)，GH 基因第5 外顯子的GH/Alu Ⅰ突變位點分型基因L 等位基因對新疆褐牛早期生長發(fā)育性狀有正向選擇作用。胡怡菲等[18]則在秦川牛GH 基因第5 外顯子發(fā)現(xiàn)2 處SNPs，其中組合ABCD 型各體尺性狀數(shù)值均高于AB 和CD 基因型，提示組合ABCD 基因型是影響秦川牛體尺性狀的最佳基因型組合。高雪等[19]研究發(fā)現(xiàn)，牛GH 基因第5 外顯子突變位點且該位點突變分型基因B 等位基因為優(yōu)勢等位基因。目前，關于貴州地方黃牛GH 基因多態(tài)性的研究未見報道，故本實驗對關嶺牛、思南牛、威寧牛和黎平牛的GH 基因進行SNP 位點檢測，首次在4 個牛種中發(fā)現(xiàn)2 個SNPs，即Exon5-G1570C、Exon5-A1720C，這與上述研究結果相符[17-19]，均在第5 外顯子發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點，說明牛GH 基因在第5外顯子具有高度多態(tài)性，但與前人所發(fā)現(xiàn)的突變位點不一致，表明不同地方的牛種具有其地方品種特點。

本研究中，2 個SNPs 均發(fā)生在編碼區(qū)，其中Exon5-G1570C 為錯義突變，編碼的纈氨酸突變?yōu)榱涟彼?，Exon5-A1720C 為同義突變，編碼的氨基酸并未發(fā)生改變。而編碼區(qū)核苷酸的改變會導致蛋白質結構改變而影響其功能[20]，故推測Exon5-G1570C 突變較Exon5-A1720C 突變會更大程度上改變牛GH 蛋白生理學功能。同時，黎平牛中僅存在Exon5-A1720C 位點，其余3 個品種均存在2 個突變位點，可能是相同環(huán)境條件下，經(jīng)過長期人工選育、優(yōu)勝劣汰使品種間差異不大或樣本量不夠所致，具體原因還需進一步驗證。通過等位基因頻率估算，在Exon5-G1570C 位點處，編碼的氨基酸發(fā)生改變且該位點基因頻率在3 個牛種（關嶺牛、思南牛、威寧牛）中差別較大，威寧牛等位基因C 頻率明顯低于其他牛種；而Exon5-A1720C 位點處，編碼的氨基酸并未改變且4 個牛種中均發(fā)現(xiàn)該突變，其中黎平牛等位基因C 頻率明顯低于其他牛種。由此發(fā)現(xiàn)，這2 個SNPs 可能與貴州地方黃牛遺傳差異有關，但仍需進一步實驗證實。本研究發(fā)現(xiàn)的突變位點均位于第5 外顯子，而外顯子的突變可能會引起mRNA 二級結構的變化，故對4 個牛品種GH 基因進行二級結構預測，發(fā)現(xiàn)Exon5-G1570C、Exon5-A1720C 位點突變均會導致其二級結構變化。具體表現(xiàn)：當Exon5-G1570C 位點堿基發(fā)生突變，Exon5-A1720C 位點為A 或C 時，mRNA二級結構發(fā)生顯著變化，穩(wěn)定性減小，自由能增大；當外顯子Exon5-A1720C 位點發(fā)生突變，Exon5-G1570C位點為G 或C 時，mRNA 二級結構穩(wěn)定性增大，自由能減小。這說明突變位置不同，對mRNA 二級結構的變化也會不同。綜上，根據(jù)本研究結果及結合前人在其他牛種上的研究成果推斷GH 基因可為貴州地方牛種生長性狀等標記輔助選擇提供相應的分子標記。

4 小 結

本研究以貴州4 個地方牛種（關嶺牛、思南牛、威寧牛、黎平牛）為實驗對象，利用混池DNA 結合PCR產(chǎn)物直接測序法檢測貴州地方黃牛GH 基因多態(tài)性，共篩選出2 個SNPs，且突變前后GH 基因mRNA 二級結構均發(fā)生改變，Exon5-G1570C 位點mRNA 自由能升高，穩(wěn)定性降低；Exon5-A1720C 位點則自由能降低，穩(wěn)定性升高，這表明突變位置不同，對mRNA 二級結構的變化也會不同。其中Exon5-G1570C 為錯義突變，編碼的纈氨酸突變?yōu)榱涟彼?，Exon5-A1720C 為同義突變，編碼的氨基酸并未發(fā)生改變，推測Exon5-G1570C 突變較Exon5-A1720C 突變會更大程度上改變牛GH 蛋白的生理學功能。進一步結合前人在其他牛種上的研究成果推斷GH 基因可為貴州地方黃牛生長性狀等標記輔助選擇提供相應的分子標記，篩選出的多態(tài)位點可為貴州地方黃牛生長相關分子標記提供參考。