金 爽 金光軍

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是由于多種病因引起的胰酶激活，導(dǎo)致胰腺局部發(fā)生炎性反應(yīng)，嚴(yán)重情況下可以導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征并發(fā)生器官功能障礙的疾病[1]，近年來(lái)急性胰腺炎的發(fā)生率逐漸上升，病死率也較高[2]。急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，其中遺傳因素在急性胰腺炎的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，成為研究的熱點(diǎn)[3,4]。囊性纖維跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子(cystic fiber transmembrane transport regulatory factor，CFTR)是一種氯離子(Cl-)通道蛋白，具有調(diào)節(jié)Cl-和鈉離子(Na+)交換的功能[5]。國(guó)外有研究者發(fā)現(xiàn)CFTR基因多態(tài)性與慢性胰腺炎相關(guān)[6,7]。目前國(guó)內(nèi)還鮮有研究報(bào)道CFTR基因多態(tài)性與急性胰腺炎的相關(guān)性。本研究采用病例對(duì)照研究的方式分析CFTR基因rs1042077(2562T>A)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與急性胰腺炎風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，具體研究報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

1.一般資料：選擇2015年12月～2017年10月期間收治的AP患者100例作為研究對(duì)象，AP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)有符合AP特征的腹痛，如急性、持續(xù)、突發(fā)且劇烈的上腹疼痛。(2)血清淀粉酶或脂肪酶活性≥3倍正常值上限。(3)增強(qiáng)磁共振成像(MRI)檢查或增強(qiáng)計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)檢查或者腹部的超聲檢查顯示有AP影像學(xué)改變?？紤]到臨床工作中AP患者多為輕度AP，為了更好地研究FTR基因rs1042077(2562T>A)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與急性胰腺炎嚴(yán)重程度相關(guān)性，降低誤差，筆者在納入病例時(shí)盡量保證輕度、中重度、重度AP患者病例數(shù)接近，結(jié)合知情同意書的簽署情況，最終入組的輕度AP(mild acute pancreatitis，MAP)23例，中重度AP(moderate severe acute pancreatitis，MSAP)42例，重度AP(severe acute pancreatitis，SAP)35例。MAP、MSAP、SAP的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合AP的診斷標(biāo)準(zhǔn)。(2)年齡>18歲。(3)初診為AP且發(fā)病后2天內(nèi)入院治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腫瘤患者。(2)有重要臟器疾病、消化系統(tǒng)疾病。(3)妊娠期或哺乳期婦女。(4)精神類疾病患者。招募100例健康體檢者作為對(duì)照組(health control，HC)。本研究中AP組和HC組一般資料詳見(jiàn)表1，兩組年齡、性別、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、收縮壓(systolic pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)等一般資料之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有受試者均簽署了知情同意書。

表1 研究組和對(duì)照組一般資料比較

BMI.體重指數(shù)；SBP.收縮壓；DBP.舒張壓

2.AP病情評(píng)價(jià)：采用Balthazar CT嚴(yán)重指數(shù)(CTSI)對(duì)AP患者的胰腺炎嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，0～3分表示為輕度、4～6分表示為中重度、7～10分表示為重度。使用APACHE Ⅱ評(píng)價(jià)AP患者的身體狀況，包括急性生理學(xué)評(píng)分、年齡評(píng)分以及慢性生理學(xué)評(píng)分等3個(gè)維度。

3. CFTR基因型檢測(cè)：提取所有受試者外周靜脈血中基因組DNA，試劑盒為天根血液基因組DNA提取試劑盒(貨號(hào)為DP318-02，批號(hào)為20150512100，公司為天根生物科技有限公司)。以提取的基因組DNA為模板，擴(kuò)增含有CFTR基因rs1042077位點(diǎn)的目的片段，PCR擴(kuò)增的引物序列為上游引物：5′-GAGAGCATACCAGCAGTGAC-3′；下游引物：5′-ACTAAGCACCAAATTAGCACAAA-3′。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為94℃變性5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s；30個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min，PCR產(chǎn)物保存在4℃冰箱，將PCR產(chǎn)物郵寄到上海生工生物工程有限公司，測(cè)序后使用Chromas 1.62分析測(cè)序結(jié)果(圖1)。

圖1 CFTR基因rs1042077(c.*2562T>A)位點(diǎn)不同基因型測(cè)序結(jié)果

結(jié) 果

1.CFTR基因rs1042077位點(diǎn)SNP與AP風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性：CFTR基因rs1042077位點(diǎn)不同基因型頻率符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05)。AP組患者與HC組比較，CFTR基因rs1042077位點(diǎn)基因型和等位基因頻率之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為6.91、8.05；P值分別為0.03、<0.01)。以野生型(TT)為參考，雜合子(TA)頻率在AP組和HC組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0.57，95%CI：0.30～1.10，P=0.07)，純合子(AA)是AP發(fā)生的保護(hù)因素(OR=0.34，95%CI：0.12～0.93，P=0.02)。等位基因分析結(jié)果顯示，A等位基因是AP發(fā)生的保護(hù)因素(OR=0.53，95%CI：0.34～0.85，P=0.01)，詳見(jiàn)表2。

表2 CFTR基因rs1042077位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

AP.急性胰腺炎;HC.健康對(duì)照組;OR.比值比;CI.可信區(qū)間

2. CFTR rs1042077位點(diǎn)基因多態(tài)性與一般資料的相關(guān)性：分析CFTR rs1042077位點(diǎn)基因多態(tài)性與受試者年齡、性別、BMI、SBP、DBP等一般資料之間的相關(guān)性，野生型(TT)與突變型(TA/AA)的年齡、性別、BMI、SBP、DBP等一般資料之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 CFTR基因型與一般資料的相關(guān)性

BMI.體重指數(shù)；SBP.收縮壓；DBP.舒張壓

3.CFTR rs1042077位點(diǎn)基因多態(tài)性與APACHE Ⅱ評(píng)分和CTSI評(píng)分的相關(guān)性：分析比較AP患者CFTR rs1042077位點(diǎn)野生型和突變型患者的APACHE Ⅱ評(píng)分和CTSI評(píng)分，野生型AP患者APACHE Ⅱ評(píng)分和CTSI評(píng)分均顯著高于突變型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.66、12.41；P均<0.01)，詳見(jiàn)表4。

表4 AP組CFTR基因型與APACHE Ⅱ評(píng)分和CTSI評(píng)分的相關(guān)性

4.CFTR rs1042077位點(diǎn)基因多態(tài)性與AP嚴(yán)重程度相關(guān)性：本研究AP患者中35例SAP，42例MSAP，23例MAP，分析CFTR基因rs1042077位點(diǎn)多態(tài)性與AP嚴(yán)重程度相關(guān)性，CFTR基因rs1042077位點(diǎn)野生型和突變型基因頻率在不同AP嚴(yán)重程度患者組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.82，P=0.000)，突變型(TA/AA)基因頻率在SAP組和MSAP組中較低，詳見(jiàn)表5。

討 論

CFTR是胰腺、膽管和腸道等上皮細(xì)胞游離膜上的一種Cl-通道，具有調(diào)節(jié)離子濃度、水分流動(dòng)和鹽類離子轉(zhuǎn)運(yùn)的作用[9,10]。CFTR結(jié)構(gòu)異?？赡軐?dǎo)致上皮層的離子和液體轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生異常，使細(xì)胞內(nèi)水分流失、分泌活動(dòng)異常，導(dǎo)致局部組織阻塞繼而發(fā)生感染[11]。

表5 CFTR rs1042077位點(diǎn)不同基因型頻率在不同嚴(yán)重程度AP患者中的分布[n(%)]

SAP.重度AP;MSAP.中重度AP;MAP.輕度AP

自從CFTR基因被鑒定以來(lái)，該基因上有接近2000個(gè)突變類型被發(fā)現(xiàn)，包括點(diǎn)突變、小缺失突變等[12]。有多種疾病被發(fā)現(xiàn)與CFTR基因突變有關(guān)，如先天性雙側(cè)輸精管缺如(CBAVD)、阻塞性精子癥、播散性支氣管擴(kuò)張癥、哮喘、慢性胰腺炎(CP)和新生兒高尿酸血癥等[13～17]。CFTR基因rs1042077(2562T>A)位點(diǎn)位于7號(hào)染色體exon 14上，據(jù)1000 Genomes Project 數(shù)據(jù)庫(kù)研究數(shù)據(jù)顯示該位點(diǎn)突變?cè)谥袊?guó)南方漢族人群中最小等位基因頻率(MAF)為0.3857，本研究中健康對(duì)照組MAF為0.365，說(shuō)明本研究所選擇的人群具有一定的代表性，比較結(jié)果較為可靠。rs1042077位點(diǎn)在dbSNP中顯示MAF為44%，在ClinVar中被解釋為“良性/可能良性”。而本研究結(jié)果顯示，在AP患者中，rs1042077位點(diǎn)MAF為0.235，且AP組患者與HC組比較，CFTR基因rs1042077位點(diǎn)基因型和等位基因頻率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此說(shuō)明CFTR基因rs1042077位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與AP的發(fā)生相關(guān)，具體表現(xiàn)為攜帶突變型A等位基因的群體可能比T等位基因攜帶者患AP概率更低。

本研究結(jié)果顯示，CFTR基因rs1042077位點(diǎn)A等位基因是AP發(fā)生的保護(hù)因素。然而，目前對(duì)于CFTR基因突變的研究大多集中以下幾個(gè)區(qū)域，如Vecchio-Pagán等[18]研究結(jié)果顯示，CFTR基因A區(qū)域(chr7: 117039250～117053000)的調(diào)節(jié)基因座與汗液氯化物水平和肺功能相關(guān)，B區(qū)域(chr7: 116941750～116951750)、C區(qū)域(chr7: 117074250～117078000)、D區(qū)域(chr7: 117153000～117156750)與汗液氯化物水平相關(guān)，而E區(qū)域(chr7: 117010500～117014250)和F區(qū)域(chr7: 117159250～117164250)與肺功能相關(guān)。而國(guó)內(nèi)外針對(duì)CFTR基因rs1042077位點(diǎn)的研究較少，從結(jié)構(gòu)上看該位點(diǎn)不屬于以上這幾個(gè)區(qū)域，由于該位點(diǎn)突變頻率較高，因此研究該位點(diǎn)與疾病的相關(guān)性具有顯著的臨床意義。

此外，分析不同臨床參數(shù)群體間CFTR基因rs1042077位點(diǎn)基因型頻率之間的差異，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)CFTR基因rs1042077位點(diǎn)基因多態(tài)性與年齡、BMI、SBP、DBP等之間具有相關(guān)性，說(shuō)明CFTR基因rs1042077位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)AP發(fā)生的影響與上述因子無(wú)關(guān)，通常單核苷酸多態(tài)性對(duì)表達(dá)的影響主要體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)、功能或者調(diào)控水平上，由于rs1042077位點(diǎn)T>A突變并未改變氨基酸的序列，筆者推測(cè)可能是影響了CFTR的表達(dá)水平。研究顯示，CFTR蛋白在胰腺癌和慢性胰腺炎中呈現(xiàn)弱表達(dá)水平，顯著低于正常胰腺組織，因此筆者認(rèn)為rs1042077位點(diǎn)T>A突變可能影響CFTR表達(dá)調(diào)控過(guò)程，導(dǎo)致CFTR蛋白的表達(dá)水平升高，從而對(duì)AP的發(fā)生具有保護(hù)效應(yīng)，但是還需要進(jìn)一步開(kāi)展體外實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。另外，本研究還分析了CFTR rs1042077位點(diǎn)基因多態(tài)性與AP嚴(yán)重程度的相關(guān)性，攜帶野生型(TT)的AP患者APACHE Ⅱ評(píng)分和CTSI評(píng)分均顯著高于突變型，而突變型(TA/AA)基因頻率在SAP組和MSAP組中較低，說(shuō)明CFTR rs1042077位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與AP的嚴(yán)重程度相關(guān)，突變型AP患者的病情比野生型輕。

本研究有以下不足之處，首先受樣本量大小的限制，部分基因型受試者數(shù)量較少，這可能放大了統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差。另外，由于本研究未能在體外模型中檢驗(yàn)CFTR rs1042077位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與CFTR蛋白表達(dá)的相關(guān)性，因此對(duì)于CFTR rs1042077位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與AP的相關(guān)性的機(jī)制缺乏直接的證據(jù)支持。

綜上所述，CFTR基因rs1042077位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與急性胰腺炎及其嚴(yán)重程度相關(guān)，突變型A等位基因可能是AP發(fā)生及其嚴(yán)重程度的保護(hù)因素，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。