羊樟福 胡 博 付佩堯 喻敏成 徐 泱

(復旦大學附屬中山醫(yī)院肝腫瘤外科-復旦大學肝癌研究所 上海 200032)

原發(fā)性肝癌惡性程度高,在全世界常見惡性腫瘤中發(fā)病率排第6位,死亡率居第2位,其中約有一半的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在我國[1]。肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的類型,約占90%[2]。近年來,盡管在HCC早診、早治方面已取得巨大進步,但患者總體預后仍較差[3-5]。由于起病隱匿,超過60%的HCC患者在首次就診時已處于中晚期,因此錯失手術機會。接受根治性切除術的患者術后1年復發(fā)率高達19%～25%,5年復發(fā)率超過70%[6-11]。因此,研究HCC發(fā)生、發(fā)展規(guī)律,探尋新的預后指標和治療靶點來提高臨床治療效果意義重大。

轉谷氨酰胺酶家族(transglutaminases,TGMs)是一類結構和功能相關性蛋白,主要以鈣離子依賴性方式催化蛋白質谷氨酸殘基與賴氨酸殘基形成共價交聯來完成特定蛋白的翻譯和修飾,目前已在人體中發(fā)現9種轉谷氨酰胺酶亞型[12-13],其中包括TGM3。TGM3廣泛表達于小腸、腦、皮膚和毛囊,在角質化細胞套膜骨架形成及毛發(fā)的生成中起重要作用[14]。TGM3表達異常與多種腫瘤發(fā)生相關,包括喉癌[15]、食管鱗狀細胞癌[16]、口腔鱗狀細胞癌[17]、頭頸部鱗癌[18]、皮膚基底細胞癌[19]等。Uemura 等[16]通過熒光差異雙向電泳和組織芯片研究發(fā)現食管鱗狀細胞癌中TGM3高表達患者預后較好。Wu 等[18]發(fā)現外源性高表達TGM3可以抑制頭頸部鱗癌細胞的增殖并促進凋亡。劉軍等[15]通過流式技術研究50例喉癌與癌旁組織TGM3表達差異,發(fā)現TGM3在喉癌中低表達并且與腫瘤轉移、分化及臨床分期相關。以上研究表明TGM3參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程,但在HCC中尚未見報道。

本文首先通過HCC根治性切除術后患者的病理標本和隨訪資料,探究TGM3在HCC及癌旁的表達水平及其對于HCC預后的預測價值;其次通過體內外實驗研究TGM3對于HCC細胞增殖、遷移和侵襲的影響;最后對TGM3在HCC發(fā)揮作用的可能分子機制進行初步研究。

資 料 和 方 法

患者信息收集28例2018年1月在復旦大學附屬中山醫(yī)院行HCC根治性切除術患者的癌和癌旁組織,用于檢測TGM3在mRNA和蛋白水平在癌和癌旁的表達差異。同時選取從2012年1月至12月在我院行HCC根治性切除術的患者92例,分析TMA染色結果及隨訪資料。本研究通過復旦大學附屬中山醫(yī)院倫理委員會審查,相關患者均簽署知情同意書。

細胞培養(yǎng)人HCC細胞系(7721、Huh7、HepG2)購自中國科學院上海細胞庫。人HCC細胞系(L02、MHCC97H、MHCC97L和HCCLM3)由復旦大學肝癌研究所提供。所有細胞均用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基(美國賽默飛世爾科技公司)置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

qRT-PCR使用RNeasy mini kit(德國Qiagen公司)提取細胞總RNA,然后使用SuperScript Ⅲ Platinum SYBR green one-step qRT-PCR kit (美國賽默飛世爾科技公司)檢測目的基因表達量。反應體系SuperScript?Ⅲ RT/Platinum?Taq Mix 1 μL,2×SYBR?Green Reaction Mix 25 μL,上下游引物各1 μL,ROX染料 0.1 μL,總RNA 5 μL,ddH2O 16.9 μL。反應條件:cDNA合成50 ℃、3 min;預變性95 ℃、5 min;95 ℃、15 s,60 ℃、30 s 重復40個循環(huán)。使用GAPDH作為內參。所用引物序列如下:TGM3,F:5’-ATGGCTGCTCTAGGAGTCCAG-3’,R:5’-GTTTTGGCCTCTCCGCAAGAT-3’;GAPDH,F:5’-ATGGGGAAGGTGAAGGT-3’,R:5’-AAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。用2-ΔΔCt值表示HCC的TGM3表達水平相對于癌旁的變化。

Western blot使用RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)裂解細胞,12 000×g離心10～15 min后收集上清,再用BCA法檢測蛋白質濃度。配置SDS-PAGE凝膠后上樣、電泳、轉膜、封閉,一抗4 ℃孵育過夜:TGM3 (1∶500)、pAKT (1∶1 000),ERK (1∶500)、pERK (1∶750)、p65 (1∶500)、Caspase 3 (1∶1 000)、Cleaved caspase 3 (1∶500)、E-Cadherin (1∶1 000)、N-Cadherin (1∶800)、Fibronection (1∶750)、Vimentin (1∶800),購自英國Abcam公司;GAPDH (1∶2 000,美國Proteintech公司);AKT (1∶800,美國CST公司);p-p65 (1∶500,美國BD公司),匹配二抗(英國Abcam公司)室溫孵育2 h,ECL化學發(fā)光檢測結果。使用Image J軟件進行灰度分析。

細胞增殖檢測取對數期細胞,消化、計數后96孔板鋪板,每孔5 000個細胞,100 μL體系,培養(yǎng)規(guī)定時間后加入10 μL CCK-8(日本東仁化學研究所),孵育2 h后于450 nm波長處檢測吸光度(D),連續(xù)測量4天。

克隆形成實驗取對數期細胞,消化、計數后6孔板鋪板,每孔1 000個細胞,2 mL體系,每4天換液1次,2周后去除培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定,0.05%結晶紫染色后拍照、計數。

Transwell小室細胞侵襲和遷移實驗稀釋Matrigel (美國Corning公司)至工作濃度,包被Transwell小室。取對數期細胞消化、計數后加入小室上室,每個上室加入105個細胞,培養(yǎng)體系為100 μL 含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基,小室下室加入600 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,作為趨化因素。置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24或48 h,觀察到有適量細胞穿出到下層即可終止實驗。取出小室,甲醇固定、結晶紫染色后拍照計數,記錄200×放大倍數下10個隨機視野。遷移實驗方法同上,但無需在小室上包被Matrigel。

TGM3敲減穩(wěn)轉細胞株構建TGM3慢病毒敲減載體由上海吉凱基因化學技術有限公司構建,共構建2個敲減載體shTGM3-1、shTGM3-2及一個陰性對照(Mock)。轉染前一天6孔板鋪板,每孔1×105個細胞,轉染時用含5 μg/mL聚凝胺培養(yǎng)基稀釋慢病毒至適宜濃度后與細胞混合,轉染12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)基,3 μg/mL嘌呤霉素篩選3天后進行后續(xù)實驗。

組織芯片與免疫組化本研究利用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法進行免疫組化染色。手術切除標本常規(guī)石蠟包埋、切片后保存于4 ℃。脫蠟復水和抗原修復后于4 ℃過夜孵育TGM3一抗,然后37 ℃二抗孵育30 min,最后行DAB顯色和蘇木精復染。TGM3染色結果判定方法如下,A:根據瘤細胞著色深淺分為4個等級,即0(不著色)、1(淺黃色)、2(棕黃色)、3(棕褐色);B:根據顯色細胞比例也分成4個等級,即1 (1%～10%)、2 (11%～50%)、3 (51%～80%)、4 (>80%);評分=A×B,0～4分:低表達;5～12分:高表達。

裸鼠皮下成瘤實驗10只6周齡雄性裸鼠購于中國科學院上海實驗動物中心,在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng),適應3天后,將裸鼠隨機分成兩組,每組5只,選擇Huh7細胞進行實驗,分別于左側腋下注射5×106個shTGM3-2 (實驗組)和Mock細胞(對照組),5周后頸椎脫臼法處死小鼠,取瘤測量后計算腫瘤體積,計算公式為:體積=0.5×長×寬2。

統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)型變量采用t檢驗或單因素方差分析,分類變量采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。用Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗研究TGM3與患者復發(fā)時間或總生存時間(overall survival,OS)的關系。用Cox回歸模型研究多因素對于患者生存和復發(fā)的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

TGM3在HCC中高表達檢測28例HCC患者癌和癌旁組織TGM3 mRNA表達水平,發(fā)現在46.4%的HCC組織中TGM3明顯高表達(≥2倍,圖1A),進一步檢測蛋白質水平的變化,發(fā)現TGM3蛋白在HCC中的表達亦顯著升高(圖1B)。

TGM3高表達HCC患者預后較差對92例在行HCC根治性切除術患者的癌和癌旁組織組成的組織芯片進行免疫組化分析,根據染色結果將患者分為TGM3高表達和TGM3低表達組(圖1C),結合臨床隨訪數據分析患者不同臨床病理參數與TGM3表達水平之間的關系(表1)。TGM3表達水平與埃德蒙森分級(Edmondson stage)顯著相關。Kaplan-Meier生存分析表明TGM3高表達組的中位復發(fā)時間和中位生存期均較低表達組顯著縮短(15.00個月vs.49.25個月,P<0.05,圖1D;38.63個月vs.未達到,P<0.05;圖1E)。多因素Cox回歸分析發(fā)現,TGM3的表達高低對于復發(fā)時間和生存時間的影響差異有統(tǒng)計學意義(HR=2.31,95%CI:1.08～4.91,P=0.029;HR=2.78,95%CI:1.28～6.00,P=0.009;表2)。以上結果表明,TGM3表達量較高的HCC患者預后較差,TGM3是HCC患者術后復發(fā)和死亡的獨立預后因素。

A:Relative TGM3 expressions assessed via qRT-PCR from tumors and paired adjacent normal liver tissues of 28 HCC patients.B:Representative TGM3 protein levels assessed via Western blot from tumors (T) and paired adjacent normal liver tissues (N) of HCC patients.C:Typical IHC images of HCC specimens that define high or low expression staining for TGM3 on TMA (bar=100 μm).D:Kaplan-Meier analysis of recurrence in HCC patients with different levels of TGM3 expression.E:Kaplan-Meier analysis of OS in HCC patients with different levels of TGM3 expression.

圖1 TGM3在HCC患者癌和癌旁組織的表達水平及其對患者預后的影響
Fig 1 The expression level of TGM3 in HCC tumors and adjacent normal liver tissues and its clinical relevance with patient outcome

TGM3下調抑制HCC細胞增殖、遷移和侵襲分別在mRNA和蛋白水平評估HCC細胞系(L02、7721、Hep G2、Huh7、LM3、97H、97L)內源性TGM3的表達水平,發(fā)現TGM3在Huh7、LM3和97H細胞株的mRNA和蛋白表達水平都較高(圖2A)。選取Huh7和97H細胞株進行后續(xù)的基因敲減實驗,分別用2個慢病毒載體(shTGM3-1和shTGM3-2)敲減細胞,Western blot檢測敲減結果(圖2B)顯示TGM3表達明顯降低。利用TGM3敲減細胞進行細胞增殖實驗,發(fā)現與轉染陰性對照相比,下調TGM3表達顯著抑制HCC細胞的增殖(P<0.05,圖2C);與增殖實驗一致,克隆形成實驗結果顯示下調TGM3表達可顯著抑制HCC細胞克隆形成(P<0.01,圖2D)。利用Transwell小室實驗評估下調TGM3表達對HCC細胞遷移和侵襲能力的影響,發(fā)現干擾后細胞遷移和侵襲能力均顯著下降(P<0.05,圖2E和2F)。以上結果表明,TGM3下調能抑制HCC細胞Huh7和97H的增殖、遷移和侵襲。

表1 入組患者臨床病理參數分析Tab 1 Correlation between clinicopathological parameters of patients enrolled

ALT:Alanine aminotransferase;AST:Aspartate transaminase;AFP:α-fetoprotein;BCLC:Barcelona clinic liver cancer.

TGM3下調抑制HCC細胞皮下成瘤通過Huh7細胞裸鼠皮下成瘤實驗進一步研究TGM3對HCC成瘤能力影響。將實驗組(shTGM3-2)和對照組(Mock)細胞各5×106個分別接種于兩組小鼠左側腋下,5周后處死小鼠取瘤,觀察發(fā)現實驗組腫瘤體積顯著小于對照組(P<0.05,圖3),提示TGM3表達降低可以抑制HCC細胞系Huh7的皮下成瘤能力。

TGM3下調抑制HCC細胞生長、遷移相關信號通路并促進調亡PI3K/AKT、MAPK/ERK及NF-κB信號通路處于細胞信號通路網的重要節(jié)點,在細胞的生長、增殖、分化、代謝、凋亡、運動等過程中起重要作用,它們的調控異常與多種腫瘤的發(fā)生相關[20-22]。利用Western blot驗證相關信號通路蛋白的變化(圖4A),探究TGM3影響HCC細胞增殖、遷移、侵襲及皮下成瘤能力的具體機制,發(fā)現TGM3下調后AKT及ERK的磷酸化水平均下降,同時引起下游p65磷酸化水平降低。同時檢測凋亡相關蛋白caspase 3的變化水平,發(fā)現其在TGM3下調的細胞中表達升高。以上結果表明,TGM3下調后可能通過PI3K/AKT、MAPK/ERK及NF-κB信號通路減弱HCC的生長和轉移,同時促進凋亡。

表2 復發(fā)與死亡的多因素Cox回歸分析Tab 2 Multivariate Cox proportional regression analysis of factors associated with recurrence and deadth

BCLC:Barcelona clinic liver cancer;HR:Hazard ratio.

A:TGM3 expression in HCC cell lines assessed by qRT-PCR and Western blot;B:Validation of TGM3 depletion assessed by Western blot in Huh7 and 97H cells;C:Proliferation of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion assessed by CCK-8 assays;D:Proliferation of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion assessed by colony formation assays (bar=5 μm);E:Migration of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion evaluated by Transwell assays without Matrigel (bar=100 μm);F:Invasion of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion evaluated by Transwell assays with Matrigel (bar=100 μm).(1)vs.mock,P<0.05.

圖2 常見HCC細胞系內源性TGM3表達水平及TGM3下調后對于HCC細胞增殖、遷移和侵襲的影響
Fig 2 The endogenous TGM3 expression levels of common HCC cell lines and the influence of TGM3 depletionon cell proliferation,migration and invasion

TGM3下調抑制HCC細胞EMT過程EMT與細胞的遷移侵襲能力密切相關[23],我們已經通過Transwell小室實驗發(fā)現TGM3下調后HCC細胞遷移、侵襲能力下降。Western blot檢測EMT相關蛋白變化(圖4B)結果表明,TGM3敲減后,上皮表型標志物E-鈣黏素表達水平上調,間葉表型標志物N-鈣黏素、纖維連接蛋白及波形蛋白均下調,表明TGM3下調后能抑制HCC細胞EMT過程。

A:Macrograph of subcutaneous tumors;B:Statistic of tumor volumes.

圖3 TGM3下調后對Huh7細胞皮下成瘤能力的影響
Fig 3 The influence of TGM3 depletion of Huh7 on subcutaneous xenotrans planted tumorigenesis

A:Effect of TGM3 depletion on the activation status of AKT,ERK,p65 and caspase 3 assessed by Western blot in Huh7 and 97H cells.B:Effect of TGM3 depletion on the expression of EMT markers assessed by Western blot in Huh7 and 97H cells.

圖4 TGM3下調對HCC細胞相關信號通路、細胞凋亡和EMT相關標志物的影響
Fig 4 The influence of TGM3 depletion on the markers of HCC signaling pathways,apoptosis and EMT

討 論

TGM3廣泛表達于小腸、腦、皮膚和毛囊,在角質化細胞套膜骨架形成及毛發(fā)的生成中起重要作用。TGM3表達異常與多種腫瘤發(fā)生相關,在喉癌、食管鱗狀細胞癌、口腔鱗狀細胞癌及頭頸部鱗癌中的研究顯示TGM3在腫瘤組織中低表達,可能是腫瘤抑制因子[15-18]。TGM3在HCC中的作用尚未見報道。本文旨在研究TGM3對于HCC的發(fā)生、發(fā)展有無影響。首先,通過比較TGM3在HCC及癌旁組織的表達差異發(fā)現,TGM3在HCC中高表達,進一步結合臨床隨訪數據,利用Kaplan-Meier及Cox回歸分析發(fā)現,TGM3表達水平是HCC術后復發(fā)和死亡的獨立影響因素,TGM3高表達的患者術后復發(fā)和死亡風險更高。所以在臨床實踐中,如果HCC患者術后病理提示TGM3高表達,臨床醫(yī)師可采取更加積極的治療措施來預防患者的復發(fā)和死亡。但這只是單中心少量樣本的統(tǒng)計結果,在臨床中的實際應用價值還需要多中心及更大樣本量的數據支持。

為研究TGM3對HCC的生物學作用,我們利用shRNA降低HCC細胞系中TGM3的表達水平,通過細胞增殖實驗和克隆形成實驗發(fā)現,TGM3下調后HCC細胞的增殖能力減弱,裸鼠皮下成瘤實驗進一步驗證了這個結論。Transwell小室實驗驗證了下調TGM3的表達能夠減弱HCC細胞的遷移和侵襲能力。以上結果表明,TGM3可能通過影響細胞增殖和遷移等相關信號通路促進HCC的生長和轉移。PI3K/AKT信號通路在細胞的生命活動中起重要的調控作用,通過與其他信號通路的相互作用共同影響細胞生長、增殖、代謝、遷移等多種病理生理過程,PI3K/AKT及MAPK/ERK信號通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[20-21,24]。本研究通過Western blot實驗證實TGM3下調后可以抑制HCC細胞AKT和ERK的磷酸化水平。AKT下游可以激活NF-κB信號通路,而NF-κB信號通路的異常激活在腫瘤侵襲和凋亡方面起重要作用[25-26]。本研究通過Western blot證實TGM3下調后p65蛋白的磷酸化水平降低,凋亡蛋白cleared caspase 3水平升高。

PI3K/AKT、MAPK/ERK、NF-κB信號通路都能對EMT過程起調控作用,而EMT與腫瘤的侵襲密切相關。在EMT過程中,上皮表型標志物E-鈣黏素下調,間葉表型標志物N-鈣黏素、纖維連接蛋白及波形蛋白上調。EMT能使上皮細胞失去極性及細胞間黏附,獲得遷移和侵襲性質,從而促進腫瘤細胞轉移[27-28]。Transwell小室實驗已證實下調TGM3表達能減弱HCC細胞的遷移和侵襲能力,通過Western blot檢測EMT相關蛋白的變化,證實TGM3下調能抑制EMT過程。

我們認為TGM3可能通過激活PI3K/AKT、MAPK/ERK、NF-κB信號通路,促進EMT過程和抑制凋亡來促進HCC的發(fā)生和發(fā)展,TGM3可能是腫瘤促進因子,這與既往文獻有一定差異。由于腫瘤遺傳及代謝的高度異質性,同一個基因在不同腫瘤中可能存在不同的功能,甚至在同一類型腫瘤的不同階段也會產生不同作用[29]。因此,TGM3在不同腫瘤中可能扮演著不同的角色。

本研究的不足之處在于:首先,TGM3是如何參與調控相關的信號通路并影響下游重要信號分子的機制仍需要進一步的闡明;其次,TGM3作為臨床預后指標的價值還需要更大樣本量的驗證。

綜上所述,本研究發(fā)現TGM3可能通過影響多條信號通路和EMT過程促進HCC的增殖和侵襲,TGM3可作為HCC患者潛在的預后指標和治療靶點。