田楓，李佶操，唐紹微，孫雨詩，林詩佳，張芳艷，謝興亮，盛艷梅（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都610500）

腦缺血又稱“中風(fēng)”，是由多種原因引發(fā)的腦局部血流量突然中斷或減少，導(dǎo)致相應(yīng)腦組織出現(xiàn)短暫性缺血，造成繼發(fā)性自主神經(jīng)功能障礙的一種病理狀態(tài)。中醫(yī)臨床在益氣活血法治療原則的指導(dǎo)下，將黃芪注射液和燈盞細辛注射液聯(lián)合用以治療腦缺血疾病，效果較好，且聯(lián)用效果優(yōu)于任一制劑單用或者常規(guī)西醫(yī)治療，但相關(guān)研究并未明確二者的最佳配比（文獻報道黃芪注射液-燈盞細辛注射液的劑量配比范圍為2∶3～5∶2）[1-3]。為此，本研究擬以改良線栓法復(fù)制大腦中動脈閉塞（MCAO）再灌注損傷大鼠模型，并運用基線等比增減設(shè)計法初步探討兩藥聯(lián)用抗大鼠腦缺血再灌注損傷的最佳配比，以期為腦缺血疾病的臨床合理用藥提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Powerwave XS2型酶標(biāo)儀（香港基因有限公司）；BSA124S-CW型千分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；LD5-2A型臺式低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；HH-Z型水浴鍋（上海常思工貿(mào)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芪注射液[黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，批號：A20150409，規(guī)格：每支裝10 mL（相當(dāng)于原藥材20 g）]；燈盞細辛注射液（云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，批號：20150346，規(guī)格：10 mL）；氯化三苯基四氮唑（TTC）（上海靈錦精細化工廠有限公司，批號：20150103）；水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號：20150501）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號均為20160515）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠，雄性，7～8周齡，體質(zhì)量250～300 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-15。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和給藥組，每組8只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均采用改良線栓法[4]復(fù)制MACO再灌注損傷模型。稱定大鼠質(zhì)量后，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，于頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），將CCA近心端用縫合線打一活結(jié)，分離并結(jié)扎翼鄂動脈，在ECA上距分叉1 cm處剪一小口，將ECA與ICA拉成一條直線，將備好的線栓經(jīng)分叉處插入ICA，插入深度約20 mm以阻斷大腦中動脈（MCA），留長約2 mm的線栓于皮膚外。阻斷大鼠MCA 2 h后（即大鼠開始有意識），抽出長約10 mm的線栓，剪去位于皮膚外的線栓，進行再灌注。待大鼠蘇醒后，觀察其運動狀態(tài)，按Longa評分法（評分標(biāo)準(zhǔn)[4]見表1）對其進行神經(jīng)功能缺損評分（若評分為＞1～3分，表明模型復(fù)制成功）。假手術(shù)組大鼠不剪開血管，僅在各綁線處綁線，其余操作同上。造模成功后，各給藥組大鼠均腹腔注射相應(yīng)藥物（給藥劑量參考臨床實際用量，以注射液體積計；采用基線等比增減法設(shè)置黃芪注射液-燈盞細辛注射液6個劑量配比組，即0∶10、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2、10∶0，分別以A、B、C、D、E、F表示；其中，A組為燈盞細辛注射液單用組，F(xiàn)組為黃芪注射液單用組），即時給藥1次，隨后24 h再給藥1次，單次給藥劑量均為2 mL/（kg·d），兩種注射液的給藥間隔為30 min；假手術(shù)組和模型組大鼠均腹腔注射等體積生理鹽水。

表1 Longa（0～4分）評分標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Longa scoring criteria（0-4 point）

2.2 評價指標(biāo)

2.2.1 神經(jīng)行為學(xué)評分 再灌注后48 h（即末次給藥后24 h）后，采用Longa評分法對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。

2.2.2 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 評分完成后，立即采集各組大鼠股動脈血適量，3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用比色法以酶標(biāo)儀檢測各組大鼠血清MDA含量以及SOD活性。嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作。

2.2.3 腦梗死率測定 取血后處死各組大鼠，立即取腦，于－20℃冰箱中速凍15 min后，去除嗅球和腦干部分，行連續(xù)冠狀切片，共5片（厚度約2 mm），經(jīng)TTC染色后，觀察各切片的梗死情況（梗死區(qū)域為白色，正常區(qū)域為紅色）；分別稱定梗死組織和腦組織質(zhì)量，計算大鼠腦梗死率[腦梗死率＝（梗死組織質(zhì)量/腦組織質(zhì)量）×100%]。

2.2.4 藥效配伍強度評價 計算各給藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低率和腦梗死率降低率，神經(jīng)功能缺損評分降低率＝[（模型組評分－給藥組評分）/模型組評分]×100%]，腦梗死率降低率＝[（模型組腦梗死率－給藥組梗死率）/模型組腦梗死率]×100%；參照金氏公式[5]計算增效指數(shù)（q），q＝甲/（乙+丙－乙×丙）（式中，“甲”表示聯(lián)用組大鼠相應(yīng)指標(biāo)的降低率，“乙”表示黃芪單用組大鼠相應(yīng)指標(biāo)的降低率，“丙”表示燈盞細辛單用組大鼠相應(yīng)指標(biāo)的降低率）；根據(jù)q值判斷藥物在配伍聯(lián)用后的治療效果是否優(yōu)于單獨給藥：當(dāng)q＞1.15時，表示兩藥合用有協(xié)同作用；當(dāng)0.85＜q＜1.15時，表示兩藥合用有相加作用；當(dāng)q＜0.85時，表示兩藥合用有拮抗作用。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，A、B、C、D、E組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低，且C組顯著低于A、F組（即單用組），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；B、C、D、E組（即聯(lián)用組）的q值分別為0.90、1.30、1.00、0.70，僅C組的q值＞1.15，詳見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of neurological impairment scores of rats in each group（±s，n＝8）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of neurological impairment scores of rats in each group（±s，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與F組比較，ΔP＜0.05；與A組比較，□P＜0.05Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.group F，ΔP＜0.05；vs.group A，□P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組A組B組C組D組E組F組黃芪注射液劑量，mL/kg燈盞細辛注射液劑量，mL/kg神經(jīng)功能缺損評分降低率，%q值0 0 0 0 0 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 0神經(jīng)功能缺損評分，分0.1.75±0.83＊＊0.88±0.58#0.63±0.48##0.13±0.33##Δ□0.50±0.50##0.88±0.60#1.00±0.70 49.7 64.0 92.6 71.4 49.7 42.9 0.90 1.30 1.00 0.70

3.2 各組大鼠血清MDA含量以及SOD活性比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清MDA含量顯著升高，SOD活性顯著減弱，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，A、B、C、D、E組大鼠血清MDA含量均顯著降低，且B、C、D、E組均顯著低于F組；A、B、C、D、E組大鼠血清SOD活性均顯著增強，且C組顯著強于F組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見表3。

表3 各組大鼠血清MDA含量以及SOD活性比較（±s，n＝8）Tab 3 Comparison of serum contents of MDA and activities of SOD of rats in each group（±s，n＝8）

表3 各組大鼠血清MDA含量以及SOD活性比較（±s，n＝8）Tab 3 Comparison of serum contents of MDA and activities of SOD of rats in each group（±s，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與F組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.group F，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

SOD，U/mL 180.94±25.37 118.33±9.28＊＊138.86±9.47##139.26±9.93##148.56±7.74##Δ 136.98±10.19#138.02±13.67#131.66±12.63組別假手術(shù)組模型組A組B組C組D組E組F組黃芪注射液劑量，mL/kg燈盞細辛注射液劑量，mL/kg 0 0 0 0 0 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 0 MDA，nmol/mL 5.20±2.50 10.90±2.38＊＊7.99±0.93##7.71±0.96##Δ 6.92±1.33##Δ 7.17±0.32##ΔΔ 8.32±1.18##Δ 10.04±0.84

3.3 各組大鼠腦梗死率比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死區(qū)域明顯增大，其腦梗死率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織梗死區(qū)域均有不同程度地縮小，其中B、C、D、E組大鼠腦梗死率均顯著降低，且C、D組顯著低于F組，C組顯著低于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；B、C、D、E組的q值分別為0.79、1.27、0.98、0.82，僅C組的q值＞1.15，詳見圖1、表4。

4 討論

腦缺血是一類常見的腦部血管疾病，屬于心腦血管疾病范疇。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報告顯示，2015年全球有1 770萬人死于心腦血管疾病，占死亡總數(shù)的31.0%，其中死于中風(fēng)的人數(shù)約占心腦血管疾病死亡總數(shù)的37.9%[6]。在2016年全球5 690萬例死亡者中，缺血性心臟病和中風(fēng)共造成1 520萬人死亡，約占死亡總數(shù)的26.7%[7]。腦缺血疾病在過去15年中一直是全球患者死亡的主要原因之一，具有發(fā)病率、病死率、致殘率和復(fù)發(fā)率均高等特點[8-9]。

圖1 各組大鼠腦梗死區(qū)觀察圖Fig 1 Observation charts of cerebral infarction area of rats in each group

表4 各組大鼠腦梗死率比較（±s，n＝8）Tab 4 Comparison of cerebral infarction rates of rats in each group（±s，n＝8）

表4 各組大鼠腦梗死率比較（±s，n＝8）Tab 4 Comparison of cerebral infarction rates of rats in each group（±s，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與F組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與A組比較，□P＜0.05Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.group F，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；vs.group A，□P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組A組B組C組D組E組F組黃芪注射液劑量，mL/kg 0.0.0.0.40 0.80 1.20 1.60 2.00燈盞細辛注射液劑量，mL/kg 0.0.2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 0.腦梗死率，%0 23.95±9.26＊＊16.43±5.35 14.23±6.50#8.29±1.22##ΔΔ□11.86±3.11##Δ 13.86±3.73#17.00±3.49腦梗死率降低率，%q值31.4 40.6 65.4 50.5 42.1 29.0 0.79 1.27 0.98 0.82

目前，西醫(yī)臨床治療腦缺血疾病主要著眼于擴張腦血管、改善微循環(huán)等方面，但其只能暫時緩解患者的臨床癥狀，總有效率低，且長期用藥不良反應(yīng)明顯，不利于患者預(yù)后[10]。而在中醫(yī)辨證論治整體思想的指導(dǎo)下配伍組方，往往可通過多層次、多途徑、多靶點綜合作用于腦缺血疾病的多個病理環(huán)節(jié)，從而在整體上有效減輕患者腦缺血再灌注損傷[11-12]。黃芪注射液是益氣藥黃芪經(jīng)提取制備而成的黃色澄明液體，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈等功效；燈盞細辛注射液則是由活血藥燈盞細辛中酚酸類成分制成的滅菌水溶液，具有活血祛瘀、通絡(luò)止痛等功效，兩藥聯(lián)用符合中醫(yī)益氣活血療法的主要原則，臨床實踐證實其聯(lián)用治療缺血性疾病的效果較好[1-3]。為進一步明確兩藥的最佳配比，本研究以MCAO再灌注損傷模型大鼠為對象，初步考察了兩藥不同配比對大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響。

鑒于腦缺血后腦微循環(huán)紊亂引起腦組織中氧自由基生成加劇，導(dǎo)致一系列氧化反應(yīng)，從而引起神經(jīng)細胞損傷，進而導(dǎo)致其神經(jīng)行為發(fā)生改變[13]，故本研究選擇神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死率以及MDA、SOD等指標(biāo)初步評價藥物對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用。其中，MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，通過MDA含量可初步評價其脂質(zhì)過氧化的程度；SOD是生物體內(nèi)氧自由基的天然清除劑，可將體內(nèi)的超氧化自由基進行轉(zhuǎn)化并予以清除[14]。本研究采用基線等比增減設(shè)計法，在已有文獻[15]的基礎(chǔ)上，探討了黃芪注射液與燈盞細辛注射液不同配比聯(lián)用對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)用能不同程度地縮小大鼠的腦梗死區(qū)域，顯著降低其神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死率和血清MDA含量，顯著升高其血清SOD活性，提示兩藥聯(lián)用能減少腦缺血再灌注所引起的應(yīng)激性腦損傷。同時本研究結(jié)果還顯示，C組大鼠的神經(jīng)缺損評分顯著低于A、F組，B、C、D、E組的q值分別為0.90、1.30、1.00、0.70；C、D組大鼠的腦梗死率均顯著低于F組，C組顯著低于A組，B、C、D、E組的q值分別為0.79、1.27、0.98、0.82；C組的q值均大于1.15，提示兩藥聯(lián)用的效果優(yōu)于單用，且當(dāng)黃芪注射液-燈盞細辛注射液的劑量比為4∶6時，兩藥具有協(xié)同增效作用。

綜上所述，以不同比例配伍的益氣藥黃芪注射液和活血藥燈盞細辛注射液對腦缺血再灌注損傷模型大鼠均有一定的保護作用，可緩解其神經(jīng)功能缺損，減輕氧化應(yīng)激，并縮小其腦梗死區(qū)域；兩藥聯(lián)用的效果優(yōu)于單用，且其最佳配比為4∶6，本研究可為中藥治療腦缺血疾病提供參考。本課題組后續(xù)將進一步采用病證結(jié)合模型對本結(jié)論進行驗證，并探討益氣活血法對氣虛血瘀型缺血性腦卒中模型大鼠腦神經(jīng)保護作用的具體機制。