林琳，魯梅，鄧意輝（沈陽藥科大學藥學院，沈陽110016）

依魯替尼是一種新型的Bruton酪氨酸激酶（BTK）抑制劑，能夠通過與BTK酶激活區(qū)域內的Cys481位點結合進而發(fā)揮抑制該酶活性、阻止腫瘤細胞轉移的作用[1-2]。目前，依魯替尼主要用于治療包括慢性淋巴細胞白血病、套細胞淋巴瘤和Waldenstrom巨球蛋白血癥在內的多種淋巴瘤[3]。但依魯替尼的水溶性極差，口服制劑的生物利用度極低，導致臨床用藥劑量偏大，患者在治療過程中易出現出血、高血壓等毒副反應，導致該藥的臨床應用受到了極大限制[4]。磷脂復合物給藥系統(tǒng)能極大地提高難溶性藥物的水溶性，增加其血藥濃度并延長藥物在體內的滯留時間，并顯著改善其生物利用度[5-7]。故本課題組前期制備了依魯替尼磷脂復合物。本研究在此基礎上，建立了測定比格犬血漿中依魯替尼濃度的高效液相色譜法（HPLC）；并以依魯替尼原料藥為對照，比較了兩者在比格犬體內的藥動學差異，以期為其新劑型的研發(fā)提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

P230型高壓恒流泵、UV200Ⅱ型紫外可變波長檢測器、HW-2000色譜數據處理工作站（大連依利特分析儀器有限公司）；AT-130型柱溫箱（天津市金洲科學儀器有限公司）；S3100型自動進樣器、SVC-Ⅱ型高精度全自動交流穩(wěn)壓器（中川電氣科技有限公司）；XS105型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DF-101S型磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器有限責任公司）；Anke TDL80-2B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；XH-D型渦旋儀（上海啟前電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

依魯替尼原料藥（南京熙澤生物科技有限公司，批號：20161213，純度：≥99%）；甲苯磺丁脲對照品（內標，大連美侖生物技術有限公司，批號：J1010AS，純度：≥99%）；蛋黃磷脂酰甘油（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號：B40643，純度：≥97%）；乙腈、冰醋酸均為色譜純，乙醇、三乙胺等試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

清潔級健康比格犬6只，雄性，8月齡，體質量10～15 kg，由沈陽藥科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（遼）2014-0004。

2 方法與結果

2.1 依魯替尼磷脂復合物的制備

參照本課題組前期研究方法制備依魯替尼磷脂復合物：稱取依魯替尼原料藥10.0 mg和蛋黃磷脂酰甘油18.0 mg，以乙醇為反應溶劑，于40℃反應0.5 h后，減壓蒸發(fā)除去乙醇，加入適量二氯甲烷洗滌以除去游離藥物，抽濾，收集沉淀，常溫減壓干燥24 h，即得依魯替尼磷脂復合物（每克磷脂復合物約含依魯替尼0.35 g）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 依魯替尼系列標準溶液 精密稱取依魯替尼原料藥5.00 mg，用甲醇稀釋，制得質量濃度為10 μg/mL的貯備液。精密量取上述貯備液適量，用甲醇稀釋至相應質量濃度，制得依魯替尼系列標準溶液，密封，于4℃保存，備用。

2.2.2 內標溶液 精密稱取內標對照品10.00 mg，用甲醇稀釋，制得質量濃度為1.0 mg/mL的內標貯備液。精密量取上述內標貯備液適量，用甲醇稀釋，制得質量濃度為50 ng/mL的內標溶液，密封，于4℃保存，備用。

2.2.3 依魯替尼混懸液 精密稱取依魯替尼原料藥適量，用0.5%交聯(lián)羧甲基纖維素鈉溶液稀釋，充分攪拌，制得質量濃度為5 mg/mL的依魯替尼混懸液，備用。

2.2.4 依魯替尼磷脂復合物混懸液 精密稱取“2.1”項下依魯替尼磷脂復合物適量，加入預熱至40℃的水中，充分攪拌，制得質量濃度為5 mg/mL的依魯替尼磷脂復合物混懸液，備用。

2.3 分組與給藥

將比格犬隨機分為兩組，即依魯替尼混懸液組和依魯替尼磷脂復合物組，每組3只。所有比格犬均禁食、不禁水12 h后，分別單次灌胃“2.2.3”“2.2.4”項下相應藥物混懸液，給藥劑量均為15 mg/kg（根據臨床使用劑量按等效劑量系數折算法[8]換算而得）。

2.4 血漿樣品處理

精密量取血漿樣品300μL，置于1.5 mL離心管中，加入50 ng/mL內標溶液100μL，加入甲醇600μL，渦旋混勻10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液于室溫下以氮氣流揮干，殘渣用流動相100μL復溶，渦旋混勻5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液適量，進樣分析。

2.5 色譜條件

色譜柱：Betasil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（含0.5%三乙胺，用冰醋酸調節(jié)pH至3.2）（45∶55，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：256 nm；柱溫：25℃；進樣量：20μL。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性 分別取空白血漿、空白血漿+依魯替尼（250 ng/mL）、依魯替尼磷脂復合物組比格犬給藥后12 h時的血漿樣品各適量，按“2.4”項下方法處理后（空白血漿不加內標），再按“2.5”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結果見圖1。由圖1可見，內標和依魯替尼的保留時間分別為7.37、11.66 min，且血漿中的內源性物質對待測物的定量分析無明顯干擾，表明本法的專屬性良好。

2.6.2 標準曲線的繪制與定量下限、最低檢測限的考察 精密量取空白血漿270 μL，置于1.5 mL離心管中，分別加入“2.2.1”項下不同質量濃度的依魯替尼系列標準溶液各30 μL，制得質量濃度分別為5、10、50、100、500、1 000、5 000 ng/mL的系列含藥血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.5”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測物質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標、待測物與內標的峰面積比值（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.007 86x－0.003 91（r＝0.999 8）。結果，依魯替尼檢測血藥濃度的線性范圍為5～5 000 ng/mL，定量下限為5 ng/mL（信噪比為10）；以信噪比為3測得最低檢測限為1.3 ng/mL。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.6.3 精密度與準確度試驗 按“2.6.2”項下方法配制同一分析批的依魯替尼定量下限以及低、中、高質量濃度（10、100、4 000 ng/mL，下同）血漿樣品各5份，按“2.4”項下方法處理后，進樣分析，考察批內精密度和準確度；同法配制3個分析批的定量下限以及低、中、高質量濃度血漿樣品，連續(xù)測定3 d，每質量濃度平行測定5次，考察批間精密度和準確度。結果，批內、批間RSD均小于10%，準確度（檢測值，下同）為98.81%～106.20%，詳見表1。

表1 精密度與準確度試驗結果Tab 1 Results of precision and accuracy tests

2.6.4 提取回收率試驗 按“2.6.2”項下方法配制依魯替尼低、中、高質量濃度血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.5”項下色譜條件進樣分析，得依魯替尼峰面積（A提取）；另取空白血漿適量，按“2.4”項下方法處理至“揮干”，殘渣加入相應質量濃度的依魯替尼標準溶液，混勻，使最終質量濃度與前者對應，再按“2.5”項下色譜條件進樣分析，得依魯替尼峰面積（A未提?。?，提取回收率＝（A提取/A未提?。?00%。每質量濃度平行5樣本分析。結果，低、中、高質量濃度血漿樣品的提取回收率分別為（84.36±2.43）%、（79.17±2.39）%、（87.50±2.33）%，RSD分別為2.89%、3.02%、2.67%（n＝5）；內標的提取回收率為（86.17±1.36）%，RSD為1.82%（n＝5）。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.6.2”項下方法配制依魯替尼低、中、高質量濃度血漿樣品，考察室溫放置3 h、反復凍融（－20℃至室溫）3次、－20℃冷凍放置3周后再處理以及處理后室溫放置24 h的穩(wěn)定性。每質量濃度平行3樣本分析。結果，在上述條件下，各樣品實測血藥濃度的RSD均小于10%（n＝3），表明其穩(wěn)定性良好，詳見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結果（n＝3）Tab 2 Results of stability tests（n＝3）

2.7 藥動學研究

6只比格犬按“2.3”項下方法分組并給藥，分別于給藥前及給藥后0.017、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12 h于左前肢靜脈取血2 mL，置于肝素化管中，4 500 r/min離心10 min，分離血漿，并置于－20 ℃保存，待檢。取上述血漿樣品適量，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.5”項下色譜條件進樣分析，代入隨行標準曲線計算依魯替尼的血藥濃度，并使用DAS 2.1.1軟件繪制平均藥-時曲線，結果見圖2。

采用DAS 2.1.1軟件處理上述平均藥-時曲線數據，計算主要藥動學參數和相對生物利用度{F，F＝[（AUC0-12h）依魯替尼磷脂復合物組/（AUC0-12h）依魯替尼混懸液組]×100%}，結果見表3。采用SPSS 20.0軟件對兩組比格犬的藥動學參數進行統(tǒng)計分析。數據均以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

由圖2可見，比格犬灌胃依魯替尼磷脂復合物混懸液后，藥物在體內吸收迅速，給藥后約0.25 h即可達最高血藥濃度，且1 h內均維持在較高水平；而灌胃依魯替尼混懸液后，藥物在體內吸收較緩慢，給藥后約2 h才達到峰值。由表3可見，依魯替尼磷脂復合物組比格犬的cmax、AUC0-12h、AUC0-∞分別為依魯替尼混懸液組的 3.78、2.08、1.74倍，其F為207.99%。與依魯替尼混懸液組比較，依魯替尼磷脂復合物組比格犬體內藥物的cmax、AUC0-12h、AUC0-∞均顯著增加，tmax顯著縮短，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 比格犬單次灌胃依魯替尼混懸液和依魯替尼磷脂復合物混懸液的平均藥-時曲線（n＝3）Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of ibrutinib in Beagle dogs after single intragastric administration of Ibrutinib suspension and Ibrutinib phospholipid complex（n＝3）

表3 比格犬單次灌胃依魯替尼混懸液和依魯替尼磷脂復合物混懸液的主要藥動學參數（±s，n＝3）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of ibrutinib in Beagle dogs after single intragastric administration of Ibrutinib suspension and Ibrutinib phospholipid complex（±s，n＝3）

表3 比格犬單次灌胃依魯替尼混懸液和依魯替尼磷脂復合物混懸液的主要藥動學參數（±s，n＝3）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of ibrutinib in Beagle dogs after single intragastric administration of Ibrutinib suspension and Ibrutinib phospholipid complex（±s，n＝3）

注：與依魯替尼混懸液組比較，＊P＜0.05Note；vs.Ibrutinib suspension group，＊P＜0.05

組別依魯替尼混懸液組依魯替尼磷脂復合物組AUC0-∞，ng·h/mL 6 174.32±525.27 10 717.33±897.62＊tmax，h 2.00±0.09 0.25±0.03＊cmax，ng/mL 610.67±21.36 2 308.72±100.41＊AUC0-12 h，ng·h/mL 4 516.67±383.43 9 394.16±874.21＊

3 討論

筆者查閱相關文獻后發(fā)現，測定依魯替尼在大鼠血漿中濃度的方法已有相關報道[9-10]，但尚未見其在比格犬體內藥動學研究的相關文獻。本研究參考上述報道，對血漿處理方法進行了改進，最終選擇了操作簡便、重復性較好的直接蛋白沉淀法。在沉淀試劑的篩選過程中，筆者發(fā)現甲醇的提取回收率最為穩(wěn)定，且處理后內源性雜質的干擾較小，故最終選擇甲醇作為蛋白沉淀試劑。同時，本研究采用乙腈-水（含0.5%三乙胺，用冰醋酸調節(jié)pH至3.2）作為流動相，并通過預試驗將其等度洗脫的比例確定為45∶55（V/V）。方法學考察結果顯示，依魯替尼和內標可基線分離，且兩者色譜峰的峰形均較好；依魯替尼檢測血藥濃度的線性范圍為5～5 000 ng/mL，批間、批內RSD均小于10%，穩(wěn)定性良好，其提取回收率穩(wěn)定（RSD＜5%），表明本研究建立的HPLC法可用于比格犬體內依魯替尼血藥濃度的測定。

磷脂復合物是指在合適溶劑中將藥物和磷脂按一定化學計量比混合而成的復合物，可顯著提高藥物的水溶性，并改善其穩(wěn)定性和透膜性，從而提高藥物的生物利用度[11]。依魯替尼在pH 4.5～8.0的水中幾乎不溶（溶解度僅為3 μg/mL），嚴重影響其在胃腸道中的吸收，故在臨床治療中必須使用大劑量才能保證藥效的充分發(fā)揮[12]。但大劑量的使用可能會增加患者發(fā)生出血、高血壓等多種毒副反應的風險[4]。將依魯替尼制成磷脂復合物后，由于磷脂與生物膜的親和性更高，可“帶領”藥物順利穿過胃腸道而被吸收入血，因此顯著增加了依魯替尼的口服吸收程度[13]。藥動學研究結果顯示，在分別灌胃依魯替尼混懸液和依魯替尼磷脂復合物后，藥物在比格犬體內的藥動學行為發(fā)生了明顯變化。其中，依魯替尼磷脂復合物的吸收速度更快，體內血藥濃度在給藥后約0.25 h即達到了峰值，且其cmax、AUC0-12h、AUC0-∞均顯著高于依魯替尼混懸液組，tmax顯著短于依魯替尼混懸液組，F為207.99%。這提示將依魯替尼制備成磷脂復合物可加快藥物在體內的吸收，并提高其生物利用度。但本研究僅選用了6只比格犬，樣本量偏小，且藥動學指標有限，后續(xù)研究將進一步擴大樣本量以減小個體差異，并深入研究依魯替尼磷脂復合物在比格犬體內的代謝過程。

綜上所述，本研究建立的HPLC法操作簡便、專屬性強、靈敏度高，可用于比格犬血漿中依魯替尼質量濃度的測定和藥動學的研究。將依魯替尼制成磷脂復合物后，其藥動學參數變化明顯，藥物吸收明顯加快，生物利用度明顯提高。