蔣翠云，任少琳，張純萍，程少文（.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥學部，?？?7002；2.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷醫(yī)學中心，海口 57002）

關節(jié)軟骨是保障關節(jié)運動的最主要結構，軟骨細胞位于軟骨組織表層，可隨著關節(jié)內微環(huán)境的變化而相應地合成和分泌基質與纖維[1]。有研究發(fā)現，在關節(jié)軟骨退變的過程中，軟骨細胞的增殖活力減弱、凋亡增多[2]。軟骨細胞的凋亡途徑主要包括線粒體途徑、內質網應激（ERS）途徑等[3]。有研究證實，抑制ERS途徑可減少軟骨基質中聚蛋白多糖酶和Ⅱ型膠原蛋白（Coll-Ⅱ）的表達，使軟骨細胞增殖活力增強、凋亡減少[4]。因此，抑制ERS途徑可使軟骨細胞恢復正常的增殖和凋亡狀態(tài)，保護軟骨細胞，減少關節(jié)軟骨缺失，對防治骨關節(jié)炎（OA）等關節(jié)軟骨退行性疾病有重要意義。二氮嗪是一種鉀離子通道激活劑，具有松弛血管平滑肌、降低血壓、抑制胰島素分泌的作用，臨床上主要用于高血壓危象急救及低血糖癥等的治療[5]。有研究表明，二氮嗪可通過抑制ERS途徑來促進骨骼肌成肌細胞的增殖并抑制其凋亡[6]。但目前尚未見二氮嗪對氧化損傷狀態(tài)下軟骨細胞增殖活力及凋亡的影響機制研究。因此，本研究從ERS途徑探討二氮嗪對氧化損傷狀態(tài)下軟骨細胞增殖活力及凋亡影響的作用機制，旨在為該藥防治關節(jié)軟骨退行性病變的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

BSA124S/BSA124S-CW型分析天平（蘇州金鉆稱重設備系統開發(fā)有限公司）；64R型低溫高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）；FYL-YS-50L型恒溫培養(yǎng)箱（美國Godinier公司）；ELx800NB型酶標儀（美國BioTek公司）；Attune NxT型流式細胞儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYCZ-24F型電泳儀（紹興上虞艾科儀器設備有限公司）；ChemiDocXRS+型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

二氮嗪（批號：022K1516，純度：98%）、30%過氧化氫（H2O2）溶液均購自美國Sigma公司；胰酶（濟南維爾康生化制藥有限公司）；Ⅱ型膠原酶（美國Worthington公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；CCK-8檢測試劑盒（上海銳賽生物技術有限公司）；Bin-ding buffer溶液（北京拜爾迪生物技術有限公司）；AnnexinⅤ-PE細胞凋亡檢測試劑盒（上海繼錦化學科技有限公司）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（武漢華瑞康生物科技有限公司）；細胞裂解液（北京華夏遠洋科技有限公司）；兔抗人胱天蛋白酶3（Caspase-3）單克隆抗體（上海滬宇生物科技有限公司）；兔抗人Bcl-2相關X蛋白（Bax）單克隆抗體（上海麥倉生物醫(yī)藥科技有限公司）；兔抗人增強子結合蛋白環(huán)磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白（CHOP）單克隆抗體（上海美恩生物技術有限公司）；兔抗人甘油三磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（武漢艾美捷科技有限公司）；過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）；ECL電化學發(fā)光試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司）；pH 7.5磷酸鹽緩沖液（PBS，上海田源生物技術有限公司）；其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級SD小鼠3只，雌性，1周齡，體質量為（20±2）g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006。

2 方法

2.1 小鼠軟骨細胞的分離與培養(yǎng)

取3只小鼠，對其膝關節(jié)作無菌處理后摘取膝關節(jié)軟骨，用眼科剪剪成絮狀，PBS沖洗，胰酶消化0.5 h，Ⅱ型膠原酶消化2 h。取上清液，以2 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入DMEM培養(yǎng)基10 mL重懸細胞后，按1×106個/皿接種于培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2恒溫箱內孵育，每72 h換液1次，當細胞生長密度達95%以上時進行消化、傳代，取第3代細胞進行后續(xù)試驗。

2.2 分組與給藥

參考文獻[6]的給藥劑量和作用時間進行分組、給藥。取第3代軟骨細胞，隨機分為對照組、損傷模型組和二氮嗪組，按1×106個/cm2的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板上。對照組細胞不作處理；損傷模型組細胞加入300 μmol/L的H2O2溶液100 μL后，在37 ℃、5%CO2恒溫箱內孵育8 h；二氮嗪組細胞加入300 μmol/L的二氮嗪溶液（以0.4%二甲基亞砜溶液為溶劑配制）100 μL，在37℃、5%CO2恒溫箱內孵育0.5 h進行預處理后，再加入300 μmol/L H2O2溶液100 μL，與損傷模型組同法孵育8 h。

2.3 軟骨細胞增殖活力檢測

采用CCK-8法檢測。取第3代軟骨細胞，按“2.2”項下方法分組、給藥并孵育完畢后，吸棄上清液，每孔加入10%CCK-8溶液100 μL，于37 ℃、5%CO2恒溫箱孵育4 h，采用酶標儀于450 nm波長下測定光密度（OD值）。試驗重復3次后取均值。按公式計算細胞增殖活力：細胞增殖活力＝（損傷模型組或二氮嗪組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

2.4 軟骨細胞凋亡率檢測

采用流式細胞術檢測。取第3代軟骨細胞，按“2.2”項下方法分組、給藥并孵育完畢后，以2 000 r/min離心5 min，棄上清，胰酶消化細胞。收集貼壁軟骨細胞，加入Binding buffer溶液500 μL重懸細胞，然后加入Annexin V-PE試劑1 μL，混勻，于25℃下避光反應10 min，在1 h內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。試驗重復3次后取均值。

2.5 軟骨細胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達量檢測

采用Western blotting法檢測。取第3代軟骨細胞，按“2.2”項下方法分組、給藥并孵育完畢后，加細胞裂解液，勻漿，12 000 r/min離心8 min；取上清液，以BCA試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白上樣，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜；將膜在5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，分別加入Caspase-3單克隆抗體（1∶200）、Bax單克隆抗體（1∶100）、CHOP單克隆抗體（1∶300）后，均與內參GAPDH單克隆抗體（1∶100）混合，4℃下孵育過夜；PBS沖洗膜，加入二抗（1∶500），37℃孵育1 h；PBS沖洗，ECL顯色、顯影。采用凝膠成像儀掃描，以Image Quant TL軟件分析各目標蛋白條帶的灰度值與內參蛋白條帶灰度值之比（即相對灰度值），用來表示目標蛋白表達量。試驗重復3次后取均值。

2.6 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組軟骨細胞增殖活力比較

與對照組比較，損傷模型組軟骨細胞增殖活力顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與損傷模型組比較，二氮嗪組軟骨細胞增殖活力顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 各組軟骨細胞的增殖活力和凋亡率（±s，n＝3）Tab 1 Proliferation activity and apoptotic rate of chondrocyte in each group（±s，n＝3）

表1 各組軟骨細胞的增殖活力和凋亡率（±s，n＝3）Tab 1 Proliferation activity and apoptotic rate of chondrocyte in each group（±s，n＝3）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與損傷模型組比較，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05；vs.injury model group，#P＜0.05

凋亡率，%32.45±1.67 75.68±2.05＊46.59±2.25#組別對照組損傷模型組二氮嗪組增殖活力，%100.00±0.00 41.29±3.02＊67.35±2.68#

3.2 各組軟骨細胞凋亡率比較

與對照組比較，損傷模型組軟骨細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與損傷模型組比較，二氮嗪組軟骨細胞凋亡率顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見圖1、表1。

圖1 各組軟骨細胞凋亡率流式細胞圖Fig 1 Flow cytograms of apoptotic rate of chondrocyte in each group

3.3 各組軟骨細胞中Caspase-3、Bax、CHOP的蛋白表達量比較

與對照組比較，損傷模型組軟骨細胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達量均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與損傷模型組比較，二氮嗪組軟骨細胞中上述蛋白表達量均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），詳見圖2、表2。

圖2 各組軟骨細胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達電泳圖Fig 2 Electrophoretograms of protein expression of Caspase-3，Bax and CHOP in chondrocyte in each group

表2 各組軟骨細胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達量（±s，n＝3）Tab 2 Protein expression of Caspase-3，Bax and CHOP in chondrocyte in each group（±s，n＝3）

表2 各組軟骨細胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達量（±s，n＝3）Tab 2 Protein expression of Caspase-3，Bax and CHOP in chondrocyte in each group（±s，n＝3）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與損傷模型組比較，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05；vs.injury model group，#P＜0.05

組別對照組損傷模型組二氮嗪組CHOP 1.04±0.02 2.62±0.22＊1.73±0.18#Caspase-3 1.03±0.03 2.41±0.23＊1.50±0.16#Bax 1.05±0.02 1.82±0.19＊1.44±0.09#

4 討論

OA是以關節(jié)基質破壞及關節(jié)軟骨細胞減少為主要病理特點的退行性關節(jié)疾病，而關節(jié)軟骨是由致密結締組織的膠原纖維構成的透明軟骨，軟骨細胞是關節(jié)軟骨中的唯一細胞成分，存在于無血管、神經或淋巴管分布的特殊微環(huán)境中，其既能合成蛋白多糖、Coll-Ⅱ等基質大分子物質，又能降解衰老退變的軟骨基質，還參與維持軟骨組織平衡[7]。有研究發(fā)現，軟骨細胞發(fā)生氧化損傷后較正常軟骨細胞在體外的增殖活力明顯減弱、凋亡明顯增多[8]。有研究顯示，H2O2可誘導骨骼肌成肌細胞凋亡，可作為氧化損傷造模試劑[9]。本研究通過H2O2誘導軟骨細胞發(fā)生氧化損傷后發(fā)現，在氧化損傷狀態(tài)下的軟骨細胞增殖活力顯著下降，凋亡率顯著升高。

軟骨細胞大量凋亡主要表現為內質網、高爾基體、溶酶體的增加以及自噬性空泡形成[10]。內質網是一種具有分泌功能的細胞器，也是蛋白質合成和細胞內信號轉導的重要場所，在ERS過程中發(fā)揮著重要作用[11]。ERS包括缺糖損傷、未折疊蛋白增加、鈣離子流失及自由基釋放過多等，這些刺激因素均可導致內質網腔內鈣離子平衡紊亂、未折疊蛋白聚集等，進而激活內質網超負荷反應，使細胞增殖活性減弱、凋亡增強，造成關節(jié)軟骨大量缺失，最終導致關節(jié)軟骨退行性病變[12]。Caspase-3、Bax、CHOP為ERS途徑相關蛋白。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵分子，在某些細胞凋亡末期的細胞裂解及凋亡小體形成過程中扮演重要角色，可激活下游的細胞凋亡蛋白酶[13]。Bax是重要的促細胞凋亡基因之一，其編碼產物可通過與B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）家族中的凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL的表達產物結合，替換Bcl-xL/Bax、Bcl-2/Bax二聚體中的Bax，而達到促進細胞凋亡的目的[14]。CHOP基因受蛋白激酶R樣內質網激酶等通路調控，是ERS誘導軟骨細胞凋亡的重要因素[15]。本研究通過Western blotting法檢測發(fā)現，損傷模型組軟骨細胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達量均較對照組顯著升高，表明軟骨細胞發(fā)生氧化損傷后其ERS作用增強，導致上述蛋白表達上調。

有研究顯示，二氮嗪可通過抑制死亡受體和線粒體途徑改善抗谷氨酸鹽、β-淀粉樣蛋白等誘導的神經細胞損傷[16-17]；其可通過阻礙ERS途徑抑制H2O2誘導的骨骼肌成肌細胞凋亡[5]。本研究結果顯示，二氮嗪組軟骨細胞增殖活力較損傷模型組顯著升高，凋亡率則顯著降低，表明二氮嗪可有效抑制氧化損傷誘導的軟骨細胞凋亡，提高軟骨細胞增殖活力。Western blotting檢測結果顯示，二氮嗪組軟骨細胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表達量均較損傷模型組顯著降低，提示二氮嗪可通過下調軟骨細胞中的上述蛋白來抑制ERS，恢復內質網功能，穩(wěn)定細胞內環(huán)境，避免氧化損傷誘導的軟骨細胞活力下降及過度凋亡，從而預防關節(jié)軟骨退行性病變的發(fā)生。這與已有研究結果相符。

綜上所述，二氮嗪可能通過抑制ERS途徑，提高軟骨細胞在氧化損傷狀態(tài)下的增殖活力，并抑制軟骨細胞凋亡，這可為防治關節(jié)軟骨退行性病變提供新的治療思路與方向，具有重要的臨床意義。但二氮嗪是否通過其他機制對氧化損傷狀態(tài)下的軟骨細胞的增殖及凋亡產生影響尚不清楚，仍需進一步研究。