江興菊，潘年松，田曉云，黃梅，羅俊#（.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽55005；.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，貴州遵義 563006）

羽扇豆醇別名蛇麻醇酯，是一種五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于多種水果（芒果、橄欖等）、蔬菜（卷心菜、青椒、西紅柿等）及藥用植物（蘆薈）中[1]。該化合物具有較強(qiáng)的抗氧化和抗炎作用，可用于病原菌感染、腫瘤及糖尿病等癥的治療[2-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇能顯著抑制肝癌、直腸癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞的生長[6-8]。同時有研究指出，該化合物可明顯抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，但作用機(jī)制尚未完全闡明[9]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可參與多種細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等[10]。研究顯示，MAPKs在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，可參與介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的增殖與凋亡[11]。然而，羽扇豆醇是否可通過MAPKs信號通路來抑制MCF-7細(xì)胞的增殖尚未見相關(guān)報道。為此，本研究以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為對象，考察羽扇豆醇對細(xì)胞增殖的影響，并從調(diào)控MAPKs信號通路的角度出發(fā)初步探討其可能機(jī)制，以期為羽扇豆醇用于乳腺癌的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

2001HY-6003型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；011007型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ELx800-MV型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；MDF-328E型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；DYY-7C型蛋白質(zhì)電泳儀（北京市六一儀器廠）；Universal HoodⅡ型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；VORTEX-5型渦旋混合器（北京貝登醫(yī)療設(shè)備有限公司）；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

羽扇豆醇對照品（上海澄紹生物科技有限公司，批號：CS1809DK01，純度：＞98%）；PD98059、SP600125、SB203580對照品（均為MAPKs信號通路抑制劑；美國Abcam公司，批號分別為ab120234、ab120065、ab120162，純度均大于99%）；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號分別為DZK0493、AD17218273）；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、結(jié)晶紫染色液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒、RIPA組織/細(xì)胞裂解液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20180212、20180125、20180411、20170815、20170830、20170913、20170425）；MTT[北京博奧拓科技有限公司，批號：298-93-1；臨用前用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）稀釋，使其最終質(zhì)量濃度為5 mg/mL]；兔源細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化 ERK1/2（p-ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號分別為#4695、#4370、#8690、#4511、#9252、#4668）；兔源甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GADPH）多克隆抗體（內(nèi)參，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10494-1-AP）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：126526）；ECL超敏發(fā)光液（美國Millipore公司，批號：WBKLS0100）；二甲基亞砜（DMSO）、乙醇等試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

2 方法

2.1 藥液配制

取羽扇豆醇對照品12 mg，用DMSO-乙醇溶液（1∶1，V/V）1 mL溶解，得質(zhì)量濃度為12 mg/mL的貯備液，于4℃保存，備用。臨用時，以DMEM培養(yǎng)基將上述貯備液稀釋至所需質(zhì)量濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取人乳腺癌MCF-7細(xì)胞適量，用含10%FBS、1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（下同）中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70%～80%后，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3 羽扇豆醇對細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞按8 000個/孔接種于96孔板上，培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁24 h后，將其隨機(jī)分為對照組和給藥組（羽扇豆醇最終質(zhì)量濃度分別為7.5、15、30、60、90 mg/L，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[12]），每組設(shè)置6個復(fù)孔。吸棄上清液，對照組細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基100 μL，給藥組細(xì)胞加入含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育3～4 h，吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，渦旋振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD490nm）值，計算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率（%）＝（試驗組細(xì)胞平均OD490nm值/對照組細(xì)胞平均OD490nm值）×100%]和半數(shù)抑制濃度（IC50）。上述試驗重復(fù)3次。

2.4 羽扇豆醇對細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的影響

取對數(shù)期生長的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞按2×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁24 h后，將其隨機(jī)分為對照組和給藥組（羽扇豆醇最終質(zhì)量濃度為15、30、60 mg/L，劑量設(shè)置參考“2.3”項下的IC50值），每組設(shè)置3個復(fù)孔。吸棄上清液，對照組細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基2 mL，給藥組細(xì)胞加入含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS清洗3次后，使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征并拍照。

2.5 羽扇豆醇對細(xì)胞克隆形成能力的影響

采用細(xì)胞克隆形成試驗檢測。取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞按500個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁24 h后，按“2.4”項下方法分組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。吸棄上清液，對照組細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基2 mL，給藥組細(xì)胞加入含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗，加入含10%FBS、1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基適量，培養(yǎng)14 d；棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1～2次，將細(xì)胞置于4%多聚甲醛溶液中固定15 min，以結(jié)晶紫染色20 min，用水沖洗，常溫晾干，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞克隆集落形成情況并拍照，同時計算克隆形成率[克隆形成率（%）＝（克隆集落形成數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù)）×100%]。上述試驗重復(fù)3次。

2.6 羽扇豆醇和MAPKs信號通路抑制劑對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞按8 000個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁24 h后，將其隨機(jī)分為對照組和給藥組（羽扇豆醇最終質(zhì)量濃度為60 mg/mL，劑量設(shè)置參考“2.3”項下的IC50值；PD98059、SP600125、SB203580最終濃度均為 10 μmol/L，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[13]；PD98059、SP600125、SB203580+羽扇豆醇聯(lián)用組的劑量同單藥組），每組設(shè)置6個復(fù)孔。吸棄上清液，對照組細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按“2.3”項下方法操作并計算細(xì)胞存活率。上述試驗重復(fù)3次。

2.7 羽扇豆醇對MARKs信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響

采用Western blotting法檢測。取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞按2×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁24 h后，將其隨機(jī)分為對照組和給藥組（羽扇豆醇最終質(zhì)量濃度為15、30、60 mg/L，劑量設(shè)置參考“2.3”項下的 IC50值；PD98059、SP600125、SB203580最終濃度均為10 μmol/L，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[13]；PD98059、SP600125、SB203580+羽扇豆醇聯(lián)用組的劑量同單藥組），每組設(shè)置3個復(fù)孔。吸棄上清液，對照組細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基2 mL，各給藥組細(xì)胞加入含相應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)24 h。使用RIPA組織/細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量。行SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入ERK1/2（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶1 000）、JNK（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）、p-38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）一抗，4℃孵育過夜，用TBST溶液清洗3次，每次5 min；加入相應(yīng)二抗（1∶5 000），室溫孵育40 min，用TBST溶液清洗3次，每次5 min；以ECL顯色后，采用凝膠成像系統(tǒng)成像并使用ImageJ v1.8.0軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參（GADPH）的條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。上述試驗重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖影響的檢測結(jié)果

與對照組比較，15、30、60、90 mg/L羽扇豆醇組細(xì)胞的存活率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見表1。羽扇豆醇的IC50值為52.94 mg/L，故本研究選擇15、30、60 mg/L進(jìn)行后續(xù)試驗。

表1 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝3）Tab 1 Effects of lupeol on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

表1 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝3）Tab 1 Effects of lupeol on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

注：與對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組7.5 mg/L羽扇豆醇組15 mg/L羽扇豆醇組細(xì)胞存活率，%61.98±1.88＊44.96±1.10＊＊36.12±2.70＊＊細(xì)胞存活率，%100.90.78±3.95 81.87±3.70＊組別30 mg/L羽扇豆醇組60 mg/L羽扇豆醇組90 mg/L羽扇豆醇組

3.2 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征影響的觀察結(jié)果

對照組細(xì)胞生長情況良好，細(xì)胞邊緣及胞核清晰。與對照組比較，經(jīng)不同劑量羽扇豆醇作用24 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，其中15 mg/L羽扇豆醇組有少數(shù)細(xì)胞脫落漂浮，細(xì)胞數(shù)量開始減少，部分細(xì)胞固縮、變圓，體積變?。?0、60 mg/L羽扇豆醇組的大部分細(xì)胞固縮、變圓，并可見大量的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，詳見圖1。

圖1 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征影響的顯微圖（×100）Fig 1 Micrographs of the effects of lupeol on the morphological characteristics of human breast cancer MCF-7 cells（×100）

3.3 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞克隆形成影響的檢測結(jié)果

與對照組比較，經(jīng)15、30、60 mg/L羽扇豆醇作用后，細(xì)胞克隆集落形成有隨劑量增加而逐漸減少的趨勢，各給藥組細(xì)胞的克隆形成率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見圖2、表2。

圖2 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞克隆形成的影響Fig 2 Effects of lupeol on the clone formation of human breast cancer MCF-7 cells

3.4 羽扇豆醇和MAPKs信號通路抑制劑對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖影響的檢測結(jié)果

與對照組比較，60 mg/L羽扇豆醇組細(xì)胞的存活率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而10 μmol/L PD98059、SP600125、SB203580組細(xì)胞的存活率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與60 mg/L羽扇豆醇組比較，各抑制劑與羽扇豆醇聯(lián)用組細(xì)胞的存活率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見表3。

表2 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞克隆形成率的影響（±s，n＝3）Tab 2 Effects of lupeol on the clone formation rate of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

表2 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞克隆形成率的影響（±s，n＝3）Tab 2 Effects of lupeol on the clone formation rate of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

注：與對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組15 mg/L羽扇豆醇組克隆形成率，%15.25±2.50＊＊3.61±2.42＊＊克隆形成率，%56.32±3.51 32.24±1.23＊組別30 mg/L羽扇豆醇組60 mg/L羽扇豆醇組

表3 羽扇豆醇和MAPKs信號通路抑制劑對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝3）Tab 3 Effects of lupeol and MAPKs signaling pathway inhibitors on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

表3 羽扇豆醇和MAPKs信號通路抑制劑對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝3）Tab 3 Effects of lupeol and MAPKs signaling pathway inhibitors on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

注：與對照組比較，＊＊P＜0.01；與60 mg/L羽扇豆醇組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.control group，＊＊P＜0.01；vs.60 mg/L lupeol group，#P＜0.05，##P＜0.01

細(xì)胞存活率，%100.48.6±2.05＊＊108.11±1.30 66.31±3.61#92.23±2.89 75.75±1.37##92.72±2.31 64.08±0.63#組別對照組60 mg/L羽扇豆醇組10 μmol/L PD98059組10 μmol/L PD98059+60 mg/L羽扇豆醇組10 μmol/L SP600125組10 μmol/L SP600125+60 mg/L羽扇豆醇組10 μmol/L SB203580組10 μmol/L SB203580+60 mg/L羽扇豆醇組

3.5 羽扇豆醇對MARKs信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)影響的檢測結(jié)果

與對照組比較，羽扇豆醇各劑量組細(xì)胞p-ERK1/2以及30、60 mg/L羽扇豆醇組細(xì)胞p-JNK、p-p38 MAPK的相對表達(dá)量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；而羽扇豆醇各劑量組細(xì)胞ERK1/2、JNK、p38 MAPK的相對表達(dá)量，15 mg/L羽扇豆醇組p-JNK、p-p38 MAPK的相對表達(dá)量以及10 μmol/L PD98059、SP600125、SB203580組細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK的相對表達(dá)量與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與60 mg/L羽扇豆醇組比較，各抑制劑與羽扇豆醇聯(lián)用組細(xì)胞p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK的相對表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而各聯(lián)用組細(xì)胞ERK1/2、JNK、p38 MAPK的相對表達(dá)量與60 mg/L羽扇豆醇組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖 3、表4（表中，“-”表示該抑制劑并非為某蛋白對應(yīng)的抑制劑，故無需檢測，無相應(yīng)結(jié)果）。

4 討論

近年來乳腺癌的發(fā)病率不斷上升，是女性癌癥患者死亡的首要原因，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[14]。目前，乳腺癌臨床治療以手術(shù)、化療、放療及綜合治療等為主，但患者預(yù)后不佳，且化療藥物副作用極大，嚴(yán)重影響了患者的治療效果[15]。因此，尋找毒性較低的治療藥物成為乳腺癌臨床研究的熱點(diǎn)之一。已有研究證實，羽扇豆醇因其較低的毒性和廣泛的藥理作用引起了學(xué)者的普遍關(guān)注，是一種極具開發(fā)價值的抗腫瘤化合物[8]。有研究表明，羽扇豆醇可抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其可能機(jī)制為該化合物可抑制細(xì)胞能量代謝途徑中生成琥珀酰輔酶A以及底物磷酸化生成腺苷三磷酸的反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞的增殖[16]。有文獻(xiàn)指出，MAPKs信號通路在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[11，17]。但羽扇豆醇對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用是否與MAPKs信號通路有關(guān)尚未見報道。為此，本研究初步考察了羽扇豆醇對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用以及該作用與MAPKs信號通路的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，15、30、60、90 mg/L羽扇豆醇均可顯著降低細(xì)胞的存活率，提示羽扇豆醇可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果[9，16]基本一致。此外，本研究測得該化合物的IC50值為52.94 mg/L，故本研究選擇15、30、60 mg/L進(jìn)行后續(xù)試驗。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，經(jīng)15、30、60 mg/L羽扇豆醇處理后，MCF-7細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了不同程度的改變，且隨著羽扇豆醇劑量的增加，細(xì)胞的數(shù)量有逐漸減少的趨勢，且可見細(xì)胞固縮、變圓、體積變小、死細(xì)胞和細(xì)胞碎片產(chǎn)生等現(xiàn)象。細(xì)胞克隆形成試驗結(jié)果顯示，15、30、60 mg/L羽扇豆醇均可顯著降低細(xì)胞的克隆形成率，且細(xì)胞克隆集落形成有隨劑量增加而逐漸減少的趨勢，進(jìn)一步證實了羽扇豆醇對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖3 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞MAPKs信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)影響的電泳圖Fig 3 Electrophoregrams of lupeol on MAPKs signaling pathway-related regulatory proteins of human breast cancer MCF-7 cells

表4 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞MAPKs信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白相對表達(dá)量的影響（±s，n＝3）Tab 4 Effects of lupeol on relative expression of MAPKs signaling pathway-related regulatory proteins of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

表4 羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞MAPKs信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白相對表達(dá)量的影響（±s，n＝3）Tab 4 Effects of lupeol on relative expression of MAPKs signaling pathway-related regulatory proteins of human breast cancer MCF-7 cells（±s，n＝3）

注：與對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與60 mg/L羽扇豆醇組比較，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.60 mg/L lupeol group，#P＜0.05

組別對照組15 mg/L羽扇豆醇組30 mg/L羽扇豆醇組60 mg/L羽扇豆醇組10 μmol/L PD98059組10 μmol/L PD98059+60 mg/L羽扇豆醇組10 μmol/L SP600125組10 μmol/L SP600125+60 mg/L羽扇豆醇組10 μmol/L SB203580組10 μmol/L SB203580+60 mg/L羽扇豆醇組ERK1/2 0.93±0.05 0.88±0.06 0.90±0.02 0.87±0.05 0.94±0.03 0.84±0.02 p-ERK1/2 0.27±0.04 0.56±0.04＊0.73±0.03＊0.80±0.02＊＊0.34±0.06 0.60±0.04#JNK 0.86±0.06 0.85±0.04 0.88±0.06 0.86±0.04 p-JNK 0.29±0.04 0.33±0.08 0.50±0.03＊0.58±0.02＊＊p-38 MAPK 0.69±0.12 0.67±0.04 0.58±0.06 0.68±0.04 p-p38 MAPK 0.39±0.05 0.48±0.04 0.68±0.05＊0.82±0.02＊＊----0.87±0.02 0.89±0.02 0.26±0.02 0.37±0.03#--------0.37±0.06 0.58±0.02#------------0.66±0.03 0.69±0.10

MAPKs家族主要有3個亞族，即ERK1/2、JNK和p38 MAPK，三者均可通過多個底物（如磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、與細(xì)胞骨架相關(guān)的細(xì)胞和酶等）來調(diào)控細(xì)胞的多種生理過程（如細(xì)胞凋亡、癌基因轉(zhuǎn)化和細(xì)胞增殖、分化等）[10，18-19]。為探討MAPKs信號通路是否參與了羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制過程，本研究選用ERK1/2抑制劑（PD98059）、JNK抑制劑（SP600125）和p38 MAPK抑制劑（SB203580）作為參照。MTT試驗結(jié)果顯示，60 mg/L羽扇豆醇組細(xì)胞的存活率較對照組顯著降低，而各抑制劑與羽扇豆醇聯(lián)用組細(xì)胞的存活率均較羽扇豆醇單用組顯著增加，表明加用ERK1/2、JNK、p38 MAPK抑制劑可逆轉(zhuǎn)羽扇豆醇對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用。這提示羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用可能與MAPKs信號通路有關(guān)。

有研究證實，MAPKs信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白的磷酸化水平對多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等均具有重要的調(diào)控作用[20-21]。Western blotting試驗結(jié)果顯示，羽扇豆醇各劑量組細(xì)胞p-ERK1/2以及30、60 mg/L羽扇豆醇組細(xì)胞p-JNK、p-p38 MAPK的相對表達(dá)量均較對照組顯著升高，各抑制劑與羽扇豆醇聯(lián)用組細(xì)胞p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK的相對表達(dá)量均較60 mg/L羽扇豆醇組顯著降低，表明加用ERK1/2、JNK、p38 MAPK抑制劑可抑制羽扇豆醇對MAPKs信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白的促磷酸化作用。這提示羽扇豆醇對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用可能與誘導(dǎo)ERK1/2、JNK、p38 MAPK磷酸化有關(guān)，這與Cao J等[13]的研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，羽扇豆醇對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)MAPKs信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白的磷酸化有關(guān)，但其具體作用靶點(diǎn)和機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步確證。