王萌萌，謝典，周育芳，李曉靜，徐步斌，周斌#（.江西科技師范大學藥學院，南昌00；.貴溪市羅河鎮(zhèn)人民政府農(nóng)綜站，江西貴溪 5400；.海軍勤務學院，天津 00450）

山慈菇系蘭科植物杜鵑蘭[Cremastra appendiculata（D.Don）Makino]、獨 蒜 蘭 [Pleione bulbocodioides（Franch.）Rolfe]或 云 南 獨 蒜 蘭（Pleione yunnanensisRolfe）的干燥假鱗莖，前者習稱“毛慈菇”，后二者習稱“冰球子”，為2015年版《中國藥典》（一部）[1]收載的常用中藥。山慈菇味甘、微辛，性涼，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、化痰散結的功效，主要用于治療癰疽惡瘡、蛇蟲咬傷、咽喉腫痛等癥[2]。藥理研究表明，山慈菇具有抗腫瘤[3-4]、抗菌[5]、降壓[6-8]等藥理活性。山慈菇主要含有菲類、聯(lián)芐類、黃酮類、糖及糖苷類等化學成分，而黃酮類成分是其有效成分之一，含量較高，藥用價值較大[9-14]。目前，有研究對山慈菇化學成分的提取分離和粗提物的藥效學等方面進行了研究[15-16]。為更好地開發(fā)、利用山慈菇資源，本研究采用超聲提取法提取了其總黃酮，采用紫外-可見分光光度法測定了山慈菇總黃酮的含量；以上述含量為指標，通過正交設計試驗優(yōu)化了提取工藝，旨在為其資源的進一步開發(fā)利用和質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2550型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；FW80型粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP225D型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

蘆丁對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：YY90103，純度：≥98%）；亞硝酸鈉（天津市福晨化學試劑廠）、硝酸鋁（天津市風船化學試劑科技有限公司）、氫氧化鈉（天津市大茂化學試劑廠）、甲醇、乙醇（西隴化工股份有限公司）均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

山慈菇藥材采自云南省麗江市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學藥學院鄧可眾副教授鑒定為山慈菇蘭科植物杜鵑蘭[Cremastra appendiculata（D.Don）Makino]的 干 燥 假鱗莖。

2 方法與結果

2.1 山慈菇中總黃酮的含量測定

采用紫外-可見分光光度法測定山慈菇中總黃酮的含量[17]。

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10.00mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度為0.4 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取經(jīng)粉碎的山慈菇粉末（過30號篩）2.0 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加70%乙醇30 mL，超聲（功率：100 W，頻率：45 kHz）提取2次，每次45 min，合并濾液，搖勻。取5 mL，置于25 mL量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.3 線性關系考察 精密量取“2.1.1”項下對照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，分別置于25 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置5 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10mL，再加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。以70%乙醇為參比溶液，于510 nm波長處測定吸光度。以質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標進行線性回歸，得蘆丁回歸方程為y＝0.012 7x+0.025 0（r＝0.999 7），表明蘆丁檢測質量濃度的線性范圍為8～48 μg/mL。

2.1.4 定量限與檢測限考察 以70%乙醇為參比溶液，于510 nm波長處連續(xù)測定6次吸光度并計算吸光度的標準偏差，以標準偏差與標準曲線線性斜率之比的10倍為定量限，以標準偏差與標準曲線線性斜率之比的3倍為檢測限。結果，蘆丁的定量限、檢測限分別為0.54、0.18 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液適量，加甲醇稀釋后按“2.1.3”項下方法處理，再于510nm波長處連續(xù)測定6次。結果，吸光度的RSD為0.29%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫放置 0、4、8、12、16、24 h 時按“2.1.3”項下方法處理，再于510 nm波長處測定吸光度。結果，吸光度的RSD為1.05%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取樣品粉末，共6份，每份約2.0 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下方法處理，再于510 nm波長處測定吸光度并按標準曲線法計算樣品中總黃酮的含量。結果，總黃酮的平均含量為2.64 mg/g，RSD為0.89%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品粉末，共6份，每份約2.0 g，精密稱定，分別加入一定量的對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下方法處理，再于510 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.1.9 樣品含量測定 取樣品粉末約2.0 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下方法處理，再于510 nm波長處測定吸光度并按標準曲線法計算樣品中總黃酮的含量，平行操作3次。結果，總黃酮含量為1.03～2.70 mg/g。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù) 精密稱取山慈菇粉末2.0 g，以“2.1.9”項下方法為手段，在料液比 1∶20（g/mL）、提取時間45 min、提取2次條件下，考察不同乙醇體積分數(shù)（50%、60%、70%、75%、80%）對山慈菇中總黃酮含量的影響，結果見圖1A。由圖1A可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，山慈菇中總黃酮的含量呈先增加后降低的趨勢，當乙醇體積分數(shù)為70%時，含量最高，故選擇乙醇體積分數(shù)范圍為70%～80%。

圖1 單因素試驗考察結果Fig 1 Results of single factor tests

2.2.2 料液比 精密稱取樣品粉末2.0 g，以“2.1.9”項下方法為手段，在70%乙醇、提取時間45 min、提取2次條件下，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40，g/mL）對山慈菇中總黃酮含量的影響，結果見圖1B。由圖1B可知，隨著乙醇用量的增加，山慈菇中總黃酮含量呈先增加后降低的趨勢，當料液比為1∶20時，含量最高，故選擇料液比范圍為1∶10～1∶20（g/mL）。

2.2.3 提取時間 精密稱取樣品粉末2.0 g，以“2.1.9”項下方法為手段，在70%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取2次條件下，考察不同提取時間（15、30、45、60、75 min）對山慈菇中總黃酮含量的影響，結果見圖1C。由圖1C可知，隨著提取時間的延長，山慈菇中總黃酮含量呈先增加后降低的趨勢，當提取時間為45、60 min時，含量最高，為節(jié)省時間，故選擇提取時間范圍為30～60 min。

2.2.4 提取次數(shù) 精密稱取樣品粉末2.0 g，以“2.1.9”項下方法為手段，在 70%乙醇，料液比1∶20（g/mL）、提取時間45 min條件下，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4次）對山慈菇中總黃酮含量的影響，結果見圖1D。由圖1D可知，隨著提取次數(shù)的增加，山慈菇中總黃酮含量呈先增加后降低的趨勢，但增加、降低幅度均較小，為節(jié)省時間和減少溶劑用量，故選擇提取次數(shù)范圍為1～3次。

2.3 山慈菇中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，以乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，總黃酮含量為考察指標，采用L9（34）正交設計試驗對其提取工藝進行優(yōu)化。因素與水平見表2，試驗方案設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 試驗方案設計與結果Tab 3 Design and results of experiment plan

表4 方差分析結果Tab 4 Results of variance analysis

由表3可知，各因素對山慈菇中總黃酮含量影響大小的順序為D＞A＞B＞C，即提取次數(shù)＞乙醇體積分數(shù)＞料液比＞提取時間，其中 A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C2＞C3＞C1、D2＞D3＞D1。

由表4可知，提取次數(shù)具有顯著性影響（P＜0.05），而乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間均無顯著性影響（P＞0.05）。

2.3.2 最優(yōu)提取工藝的確定及驗證試驗 綜合考慮節(jié)約資源和成本，最終確定山慈菇中總黃酮的最優(yōu)提取工藝為A1B2C2D2，即70%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取時間45 min、提取次數(shù)2次。按此工藝條件進行驗證試驗，平行操作3次，結果見表5。由表5可知，優(yōu)化所得工藝條件穩(wěn)定、可行。

表5 驗證試驗結果（n＝3）Tab 5 Results of validation tests（n＝3）

3 討論

筆者在前期預試驗中比較了加熱回流提取和超聲提取的效果。結果顯示，超聲提取所得總黃酮的含量顯著高于加熱回流提取，故選擇超聲提取法提取山慈菇中的總黃酮。該方法可節(jié)省溶劑和提取時間，且提取條件相對溫和，尤其適用于易氧化、易分解、熱不穩(wěn)定的物質[18-19]。

本研究在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優(yōu)化了山慈菇中總黃酮的提取工藝條件。結果顯示，影響山慈菇總黃酮含量大小的因素順序為提取次數(shù)＞乙醇體積分數(shù)＞料液比＞提取時間；優(yōu)化提取工藝條件為70%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取時間45 min、提取次數(shù)2次，在此條件下山慈姑中總黃酮的平均含量為2.74 mg/g。

黃酮類化合物是山慈菇的有效成分之一，具有保護心血管、抗炎、抗菌、抗病毒等藥理作用[3-8，20-21]。本研究采用紫外-可見分光光度法測定了山慈菇中總黃酮的含量，可為山慈菇中總黃酮的進一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，本研究所建含量測定方法簡單、準確；所得提取工藝穩(wěn)定、可行。