李志惠，李杰章，張依裕*

（1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧水產(chǎn)系，貴州清鎮(zhèn) 551400；2.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

地方鴨種的研發(fā)一直是畜牧業(yè)的重要組成部分。目前，越來越多的畜禽品種資源出現(xiàn)不同程度的減少，究其原因還是我們對這些畜禽品種認(rèn)識不夠深入，如興義鴨、納雍糯谷豬、長順綠殼蛋雞等（林家棟等，2008；焦仁剛，2008），加強(qiáng)對相關(guān)畜禽品種資源的研究是推動畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑，也是加快從傳統(tǒng)地方畜禽養(yǎng)殖轉(zhuǎn)變?yōu)樾滦偷胤叫笄蒺B(yǎng)殖的捷徑，為實(shí)現(xiàn)富農(nóng)強(qiáng)農(nóng)提供更多的參考。

微衛(wèi)星由少數(shù)核苷酸（通常是以1～6個堿基為重復(fù)單位）組成的串聯(lián)重復(fù)序列，因其重復(fù)程度和次數(shù)的不同造就了微衛(wèi)星具有高度多態(tài)性、在基因組中可以大量存在、均勻分布和變異強(qiáng)度大等優(yōu)點(diǎn)，成為一種常用的分子標(biāo)記方法，運(yùn)用該方法可以迅速從基因組中選取微衛(wèi)星序列并順序化，能高效率的使用PCR方法擴(kuò)增和進(jìn)行凝膠電泳的分析（盛巖等，2002）。段修軍等（2008）、馬洪雨等（2006）利用微衛(wèi)星標(biāo)記法在不同的畜禽領(lǐng)域取得了研究成果，本次試驗(yàn)分析方法參照上述前輩的方法，運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記分析興義鴨的遺傳多樣性，旨在加速興義鴨開發(fā)利用的進(jìn)程，豐富地方鴨種的基因庫，更好地保護(hù)地方畜禽資源，既保障畜牧業(yè)的健康發(fā)展和相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)，同時也為地方畜禽的育種工作帶來一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 研究所采集的興義鴨樣本是經(jīng)貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院出資，由貴州省金沙縣禹謨鎮(zhèn)的專業(yè)養(yǎng)殖戶提供養(yǎng)殖場地，在養(yǎng)殖過程中半封閉飼養(yǎng)，公母隔離，飼養(yǎng)過程中保持營養(yǎng)水平相同、飼養(yǎng)管理基本一致，將雛鴨（120只）喂養(yǎng)至10周齡，隨機(jī)選擇健康、體質(zhì)好的興義鴨60只（♀：47只；♂：13只）翅膀靜脈采集血樣，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微衛(wèi)星引物 本研究采用20對引物的微衛(wèi)星引物序列進(jìn)行合成，合成公司為上海生物有限股份公司，各引物序列及退火溫度和片段范圍見表1。

1.3 基因組DNA提取 取常用的酚/氯仿抽提法來提取樣品中DNA，制備1%瓊脂糖凝膠，對提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V、20 min，在完成瓊脂糖凝膠電泳檢測后，運(yùn)用紫外分光光度計(jì)測量DNA濃度已經(jīng)足夠高，可用于完成后繼實(shí)驗(yàn)，放置于-20℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

?表1 微衛(wèi)星引物的序列及退火溫度

1.4 PCR反應(yīng)與PCR產(chǎn)物檢測 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體系：加入0.8 μl的DNA模板，上游引物和下游引物均各加1.1 μl，滅菌雙蒸水加6 μl，Ultra S8YBR Mixture（mixRox）加 11 μl，最終總體積為20 μl。建立PCR反應(yīng)程序，預(yù)變性溫度是 95℃、5 min，變性溫度是 95℃、30 s，退火溫度是 60℃、50 s，72℃延伸 30 s，共 40個循環(huán)；72℃延伸10 min；10℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PAGE凝膠電泳，電泳儀電壓設(shè)置為120 V、16 min，電泳完成后放置在凝膠成像儀上，觀察并截圖保存。

1.5 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)條帶位置確定基因型，其中微衛(wèi)星座位的有效等位基因數(shù)（Ne）由公式：計(jì)算。微衛(wèi)星座位的等位基因頻率（P）由公式 ：Pi=[2（ii）+（ij1）+（ij2）+ …+（ijn）]/2N計(jì)算。微衛(wèi)星座位的多態(tài)信息含（PIC）由公式。微衛(wèi)星座位的基因雜合度（H）由公式

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA質(zhì)量檢測 提取興義鴨血樣DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，結(jié)果見圖1。由圖1可見，DNA完整性較好，NANODROP 2000 DNA濃度測定儀檢測結(jié)果顯示，OD260/OD280為 1.8～2.0。

圖1 鴨血基因組DNA檢測

2.2 微衛(wèi)星座位的多樣性檢測 通過12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測微衛(wèi)星座位的多態(tài)性，圖譜見圖2。由表2可知，20對微衛(wèi)星引物均能擴(kuò)增出特異性條帶，顯示出20對微衛(wèi)星引物的均顯現(xiàn)出多態(tài)，部分引物擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)高度變異性，均可用于群體遺傳多樣性的評估。

圖2 AJ272580 和?AJ272579 引物 PCR?產(chǎn)物的電泳圖譜

2.3 微衛(wèi)星基因座等位基因數(shù)及等位基因頻率根據(jù)各微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增條帶和擴(kuò)增片段大小范圍，統(tǒng)計(jì)其每個微衛(wèi)星基因座等位基因數(shù)及等位基因頻率，結(jié)果顯示，在20對微衛(wèi)星引物中共檢測到85個等位基因，平均每個微衛(wèi)星基因座等位基因數(shù)4.2500個，AJ272580座位等位基因有7個，AJ272579和AJ272581座位等位基因各6個，AJ272582、AJ515884、AJ515887、AJ515890、AJ515893等位基因數(shù)均為5個，AJ272577、AJ272583、AJ515891、AJ515896、AJ515898、AJ515899等位基因數(shù)均為4個，AJ272578、AJ515883、AJ515889、AJ515895、AJ515900等位基因數(shù)均為3個，AJ515897座位等位基因最少，為2個。

2.4 微衛(wèi)星基因座群體雜合度、多態(tài)信息含量和有效等位基因數(shù) 結(jié)果見表2，20個微衛(wèi)星基因座群體雜合度中，位點(diǎn)AJ272580的群體雜合度最高，為0.8304，位點(diǎn)AJ515883的群體雜合度最低，為0.4919，其他的群體雜合度大多是在0.59～0.79之間，各位點(diǎn)平均群體雜合度為0.6850。多態(tài)信息含量最高的是位點(diǎn)AJ272580的0.8085，多態(tài)信息含量最低的是位點(diǎn)AJ515897的0.3733，其他的大多為0.50～0.77，各位點(diǎn)平均多態(tài)信息含量為0.6284。有效等位基因數(shù)最高的是位點(diǎn)AJ272580的5.8955，最低的是位點(diǎn)AJ515883的1.9681，其他大多為2.5～4.9，各位點(diǎn)有效等位基因數(shù)的平均值是3.4449。

3 討論

群體雜合度可以用于測定每個種群的遺傳變異，由表2可見，興義鴨的群體平均雜合度0.6850大于0.5，表明興義鴨的群體遺傳多樣性水平較大，可用于進(jìn)一步選擇。常洪（2003）指出，在探討遺傳多樣性抽樣時，樣本的雌雄比是4∶1，且樣本數(shù)應(yīng)達(dá)到60羽，符合前人要求，在凝膠判定基因型時條帶應(yīng)清晰，上述要求本試驗(yàn)基本達(dá)到。

表2 微衛(wèi)星基因座群體雜合度、多態(tài)信息含量?和有效等位基因數(shù)

多態(tài)信息含量是評估物種遺傳多樣性的一個良好的指標(biāo)，根據(jù)Botstein等研究結(jié)果，興義鴨AJ515883位點(diǎn)和AJ515897位點(diǎn)的PIC為0.25～0.5，表現(xiàn)為中度多態(tài)位點(diǎn)，剩下的18個微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC均大于0.5，呈現(xiàn)出高度多態(tài)，興義鴨的平均PIC為0.6284均大于0.5，這20個位點(diǎn)均能用于反映出興義鴨的高度遺傳多樣性。要想較好的用做遺傳多樣性的評估，每一個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因都應(yīng)擁有4個以上，由微衛(wèi)星基因座等位基因數(shù)及等位基因頻率結(jié)果可以看出，20個微衛(wèi)星位點(diǎn)里只有AJ272578、AJ515883、AJ515889、AJ515895、AJ515897、AJ515900這 6個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因都小于4，沒有呈現(xiàn)高度的多態(tài)，只表現(xiàn)出中度或低度多態(tài)。有效等位基因數(shù)也是標(biāo)榜一個群體遺傳變異的尺子，有效等位基因數(shù)和等位基因的絕對數(shù)越相近，群體中等位基因的分布越平均，平均有效等位基因數(shù)為3.4449，表明20個微衛(wèi)星基因數(shù)較大，其遺傳多樣性較豐富，人們就能有更好的能力來保持有效等位基因的選擇。

結(jié)合湯青蘋等（2006）的研究，影響最終試驗(yàn)結(jié)果的原因包括所采集的樣本均由興義本地提供，由于當(dāng)?shù)亟煌ú焕?，農(nóng)產(chǎn)品也基本自給自足，導(dǎo)致興義鴨與外界鴨種的基因交流不暢，較好保留了其基因的完整性，所以試驗(yàn)動物具有代表性，這項(xiàng)研究中對興義鴨的選育保種帶來了一份珍貴的參考資料?？偠灾Y(jié)果表明，本試驗(yàn)所用的20個微衛(wèi)星位點(diǎn)都能用于鴨類遺傳多樣性的檢查。