俞煥騰,馬 骉,2,方結(jié)紅,林委,張明洲,2

(1．中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018；2．浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,浙江 杭州 310018)

子宮頸癌是一種常見婦科惡性腫瘤,對女性健康造成很大影響[1]。在我國,宮頸癌的發(fā)病率快速上升,是發(fā)病率增長速度最快的癌癥,居女性生殖系統(tǒng)腫瘤首位[2]。研究發(fā)現(xiàn),高危亞型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌頻發(fā)的主要原因。因此,檢測宮頸細(xì)胞樣本中HPV載量和基因型,已成為宮頸癌預(yù)判的一種常規(guī)診斷途徑,為早期治療方案的制定提供依據(jù)。

如今,傳統(tǒng)培養(yǎng)法已經(jīng)滿足不了快速檢測的要求,子宮頸癌的早期診斷需另辟新徑[3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,結(jié)合當(dāng)下流行病學(xué)的研究現(xiàn)狀,針對HPV病毒的臨床診斷試劑種類較多。按照分子生物學(xué)的方法學(xué)原理,主要分為3類:熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)、基因芯片技術(shù)(gene chip technique)、第二代雜交捕獲技術(shù)[4](Hybrid capture 2)。這些技術(shù)以高特異性、高靈敏度等優(yōu)勢,為病毒的快速篩查提供了支持。然而,相較于等溫擴增方法,這些檢測技術(shù)較大程度的依賴精密設(shè)備,不適用于現(xiàn)場快速診斷[5-6]。

作為一種高效恒溫的核酸擴增技術(shù),環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)利用獨特的鏈置換循環(huán),在60 ℃～65 ℃的恒溫環(huán)境下,短時間內(nèi)實現(xiàn)靶序列的大量擴增[7]。擴增產(chǎn)物的常規(guī)驗證多由瓊脂糖凝膠電泳和濁度檢測等手段實現(xiàn)。為解決開蓋污染等問題,在反應(yīng)液中添加鈣黃綠素等熒光染料,根據(jù)反應(yīng)前后顏色的變化,實現(xiàn)可視化判讀反應(yīng)結(jié)果[8]。同時,結(jié)合半定量分析的檢測要求,利用鈣黃綠素染料(最大激發(fā)波長515 nm,最大吸收波長495 nm)與SYBR Green I染料最大熒光吸收(487 nm)/發(fā)射波長(520 nm)相近的特點,選擇使用熒光定量PCR儀對反應(yīng)過程進行實時監(jiān)測[9]。

本研究選取臨床診斷試劑市場上廣泛應(yīng)用的HPV反向雜交方法檢測試劑盒,作為對照檢測手段,方便進行實驗數(shù)據(jù)的比對與校驗。

1 材料與方法

1.1 材料

15種高危亞型HPV16(n=29), HPV18(n=26), HPV31(n=18), HPV33(n=22), HPV35(n=10), HPV39(n=9), HPV45(n=5), HPV51(n=15), HPV52(n=61), HPV56(n=14), HPV58(n=22), HPV59(n=8), HPV68(n=9), HPV73(n=2), HPV83(n=3)的陽性臨床樣本、非高危型陽性樣本(n=132)和陰性臨床樣本(n=65)均由溫州美眾醫(yī)學(xué)檢驗所惠贈。制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞所用的大腸桿菌菌株由浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室保存與提供。LB Broth培養(yǎng)基,dNTPs,8U/μLBst2.0 DNA聚合酶,HPV反向雜交方法檢測試劑盒,病毒基因組DNA快速提取試劑盒分別購自生工生物工程(上海)股份有限公司,美國Thermo Scientific公司,英國NEB公司,亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司以及百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)人乳頭瘤病毒的L1基因的高度保守的序列(GenBank登錄號),HPV16(K02718),HPV18(AY262282), HPV31(J04353),HPV33(M12732),HPV35(M74117),HPV39(M62849),HPV45(X74479),HPV51(M62877),HPV52(X74481),HPV56(X74483),HPV58(D90400),HPV59(X77858),HPV68(X67161),HPV73(X94165),HPV83(AF151983)設(shè)計LAMP引物(表1)。LAMP引物利用Primer Explorer version 5.0在線軟件設(shè)計,包括F3/B3(上/下游外引物)、FIP/BIP(上/下游內(nèi)引物),部分含有LF/LB(上/下游環(huán)引物)。引物委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。F3/B3引物組用于構(gòu)建重組質(zhì)粒。

表1 HPV高危亞型特異性LAMP引物組序列

續(xù)表1

1.3 病毒DNA模板提取

為了滿足快速檢測的要求,本研究采用試劑盒法,提取病毒基因組DNA。取200 μL含病毒的液體,根據(jù)百泰克病毒基因組DNA快速提取試劑盒操作手冊進行基因組DNA提取,提取產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時可視化LAMP分析方法的建立

將混勻的LAMP反應(yīng)液置在65 ℃恒溫條件下,每個等溫循環(huán)設(shè)置為1 min,擴增60個循環(huán)后分析反應(yīng)結(jié)果。一方面可以通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色進行判斷(熒光綠色為陽性,黃褐色為陰性),另一方面可借助熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96TM)的熒光曲線圖進行半定量分析。

1.5 實時可視化LAMP方法的特異性和靈敏度

特異性:針對HPV病毒的15種高危亞型,采用已建立的實時可視化LAMP技術(shù),擴增目的片段,觀察有無交叉反應(yīng)出現(xiàn),以此來評價檢測方法的特異性。

靈敏度:將陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒定量,隨后進行10倍梯度稀釋,用于實時可視化LAMP檢測,分析實時可視化LAMP方法的靈敏度。

1.6 實際樣品檢測

本研究中使用的宮頸組織樣本,采集自女性婦科體檢過程,包括宮頸分泌物和宮頸組織脫落細(xì)胞。溫州美眾醫(yī)學(xué)檢驗所統(tǒng)一對樣本進行滅活處理。使用實時可視化LAMP方法對樣本基因組擴增,并與檢驗所的分析結(jié)果進行比較,對比并分析臨床實際樣本的總體檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 實時可視化LAMP體系優(yōu)化

通過優(yōu)化,實時可視化LAMP的最優(yōu)反應(yīng)體系如下:引物比為1∶8∶4(0.4 μmol/L外引物F3/B3,3.2 μmol/L內(nèi)引物FIP/BIP,1.6 μmol/L環(huán)引物L(fēng)F/LB),Tris-HCl(pH=8.8)終濃度為20 mmol/L,KCl終濃度為10 mmol/L,MgSO4終濃度為8 mmol/L,(NH4)2SO4終濃度為10 mmol/L,Tween 20終濃度為0.1%,Betaine終濃度為800 mmol/L,鈣黃綠素終濃度為300 mmol/L,MnCl2終濃度為500 mmol/L,dNTPs終濃度為5.6 mmol/L,25 μL反應(yīng)體系中加入Bst DNA聚合酶8U,DNA模板添加2.5 μL。

2.2 實時可視化LAMP特異性

10倍梯度稀釋15個高危亞型的HPV病毒基因組DNA,其中用于特異性實驗的模板DNA濃度大約為10 ng。以HPV58亞型為例(圖1),觀察各反應(yīng)管顏色變化,結(jié)合擴增曲線進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示,并無交叉反應(yīng)發(fā)生。另外,其他14個高危亞型實驗過程中也并未發(fā)生非特異性擴增。

a:靈敏度實驗擴增曲線,1—108copies/μL,2—107copies/μL,3—106copies/μL,4—105copies/μL,5—104copies/μL,6—103copies/μL,7—102copies/μL,8—101copies/μL,9—陰性對照；b.靈敏度實驗實物；c.特異性實驗擴增曲線;d.特異性實驗實物.圖1 HPV58亞型可視化LAMP反應(yīng)Figure 1 The result of HPV 58 type for the LAMP assay

2.3 實時可視化LAMP靈敏度

使用滅菌水10倍梯度稀釋后的15個HPV高危亞型病毒重組質(zhì)粒,作為模板DNA進行靈敏度實驗,并且各稀釋梯度重復(fù)3次實驗。實驗結(jié)果如下:HPV68的檢測限達(dá)105copies/μL;HPV18,56的檢測限達(dá)104copies/μL;HPV31,39,45,52,58,83的檢測限達(dá)103copies/μL;HPV35,51的檢測限達(dá)102copies/μL;HPV16,33,59,73的檢測限達(dá)101copies/μL。反應(yīng)結(jié)束后,模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)值為x軸,擴增起始時間為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)。

表2 高危HPV亞型LAMP實驗標(biāo)準(zhǔn)曲線

Table 2 The standard curves of LAMP assay for high-risk HPV test

亞型標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)HPV16y=-1.544x+31.814R2=0.980HPV18y=-2.699x+44.794R2=0.987HPV31y=-2.475x+49.455R2=0.972HPV33y=-2.124x+43.698R2=0.971HPV35y=-2.916x+52.320R2=0.930HPV39y=-2.603x+44.539R2=0.976HPV45y=-3.457x+59.772R2=0.951HPV51y=-1.738x+31.473R2=0.958HPV52y=-7.440x+97.798R2=0.963HPV56y=-5.903x+94.250R2=0.954HPV58y=-1.761x+34.686R2=0.983HPV59y=-2.890x+46.488R2=0.974HPV68y=-11.469x+149.864R2=0.917HPV73y=-3.100x+50.339R2=0.970HPV83y=-7.333x+103.901R2=0.967

2.4 臨床樣本檢測結(jié)果的比對分析

針對318例臨床樣本(132例非高危型陽性樣本不計數(shù)),LAMP的陽性檢出率達(dá)到79.56%(253/318),與檢驗所使用的反向雜交試劑盒檢測結(jié)果持平(79.56%,253/318)。但是有14例臨床樣品檢測結(jié)果不一致,比例達(dá)4.4%(14/318)。陽性檢出率之間的差異,可能與LAMP檢測手段針對某些高危亞型的高靈敏度有關(guān)。兩種檢測方法的符合率為91.20%,Kappa值為0.73(表3)。多亞型感染樣本在整體統(tǒng)計分析中未做單獨標(biāo)識,是造成Kappa值偏低的主要原因[10]。

考慮到實驗的準(zhǔn)確性,我們分別對15組高危亞型(253例)的對比檢測結(jié)果,進行了數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計結(jié)果詳見表4。兩種檢測方法的匹配程度可以通過單一樣本的Kappa值來判斷。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,15組Kappa值均大于0.85,表明兩種檢測方法針對單一高危亞型的匹配程度良好。由此可以推斷,LAMP方法和反向雜交方法在高危亞型的檢測上,其效率和準(zhǔn)確性基本一致。

表3 高危亞型HPV臨床樣本的LAMP檢測結(jié)果和反向雜交結(jié)果對比

注:反向雜交(reverse dot blot, RDB),置信區(qū)間(confidence interval, CI),高危亞型(high-risk HPV, HR-HPV),陽性結(jié)果(+),陰性結(jié)果(-)。

表4 LAMP方法和RDB方法的Kappa值及對比分析結(jié)果

3 討 論

近年來,熒光定量PCR技術(shù)憑借高特異、高敏感、穩(wěn)定、準(zhǔn)確等優(yōu)勢已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒檢測領(lǐng)域。該方法不僅可以進行定量分析,還能降低因污染造成的假陽性比率。然而,在基層地區(qū)的診斷市場中,該方法受到相對高成本的反應(yīng)試劑和過于昂貴的儀器設(shè)備的影響,并不適合全覆蓋式推廣使用。本研究建立的實時可視化LAMP方法,不受上述因素的限制,判讀反應(yīng)結(jié)果僅需肉眼觀察顏色變化,無須電泳鑒定。同時,由氣溶膠引起的開蓋易污染問題也得到了很好的解決[11-15]。作為篩選后的熒光指示劑,應(yīng)用鈣黃綠素染料不僅可以和熒光數(shù)據(jù)收集儀器實現(xiàn)無縫銜接,方便建立半定量分析的數(shù)據(jù)模型,而且可以在自然光線下,不借助任何讀數(shù)儀器,通過肉眼觀察染料顏色的變化,間接定性地判讀實驗結(jié)果。在本研究中,借助熒光定量PCR儀收集實驗數(shù)據(jù),不僅可以更直觀的指導(dǎo)各反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化,還為半定量的LAMP方法的建立提供可靠依據(jù),進而為今后深入探究LAMP定量分析方法奠定基礎(chǔ)。但是靈敏度實驗中反映出的各亞型間的差異性,可能與篩選引物組擴增效率有關(guān),進一步優(yōu)化反應(yīng)體系,篩選獲得高效的引物組,是提高敏感性的有效手段。本研究建立的實時可視化HPV-LAMP方法,除兼具高靈敏、高特異、高效率的特點外,擺脫了對精密儀器的依賴,降低了出現(xiàn)假陽性結(jié)果的概率,簡便的操作更適用于偏遠(yuǎn)基層地區(qū)的現(xiàn)場快速檢測,在商業(yè)和臨床檢測領(lǐng)域均具備較為廣泛的應(yīng)用前景。