張 慧,陳景志,陳建立,張 琪,張國(guó)志

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院普外科(唐山 063000)

結(jié)直腸癌是臨床上常見(jiàn)的消化道腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率分別居全球癌癥發(fā)病率和病死率的第3位和第2位，2018年全球新增結(jié)直腸癌患者約185萬(wàn)例，死亡約88萬(wàn)例[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)病率與國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平呈正相關(guān)，欠發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)直腸癌的發(fā)病率僅為發(fā)達(dá)國(guó)家的1/3左右。相對(duì)于發(fā)病率來(lái)說(shuō)，結(jié)直腸癌的病死率在全球各地區(qū)差異較小[2]。發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)直腸癌病死率下降主要原因是有效且規(guī)范的腫瘤治療管理策略以及針對(duì)結(jié)直腸癌開(kāi)展大規(guī)模的篩查及早診早治項(xiàng)目[3]。目前結(jié)直腸癌的發(fā)病原因尚不明確，有研究表明，超重和肥胖[4]、久坐[4-5]、紅肉和加工肉制品的攝入[6]可增加患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，體育鍛煉[4-5]、谷類等植物性食物[7]、魚(yú)類[8]、維生素D[9-10]、鈣[11]、葉酸[12]的攝入會(huì)降低患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。由于結(jié)直腸癌早期缺乏典型的癥狀和體征，且缺乏高靈敏度和強(qiáng)特異性的早期診斷技術(shù)，大部分患者就診時(shí)已是中晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，因此臨床上應(yīng)進(jìn)行早期診斷，積極采取治療措施[13]。結(jié)直腸癌缺失基因(Delected in colorectal carcinoma ,DCC)被認(rèn)為是最大的抑癌基因之一，參與結(jié)直腸癌的演變及轉(zhuǎn)移。絲裂原活化蛋白激酶激酶4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，可同時(shí)磷酸化并激活JNK及P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化及凋亡等。本研究采用RT-PCR、Western-blot、免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)60例結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中DCC、MKK4的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的診斷提供新的生物學(xué)標(biāo)記和腫瘤基因治療的靶點(diǎn)。

資料與方法

1 一般資料 收集60例華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院2017年9月至2018年8月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，其中男38例，女22例；≤60歲患者36例，>60歲患者24例，腫瘤位于結(jié)腸者32例，位于直腸者28例；隆起型25例，潰瘍型30例，浸潤(rùn)型5例；高分化者12例，中分化者40例，低分化者8例；伴有淋巴轉(zhuǎn)移19例，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移41例；伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移10例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移50例；浸潤(rùn)深度：T14例、T214例、T336例、T46例。所有患者術(shù)前均未接受化學(xué)藥物治療及放射治療。所有手術(shù)標(biāo)本于術(shù)后30 min內(nèi)置于液氮中，-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，癌旁組織取距離腫瘤邊緣5 cm以上的組織。

2 主要試劑 PCR試劑：DCC、MKK4引物(美國(guó)Invitrogen公司)，TRIpure Reagent(上?？道噬锕?，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Gene Copoeia公司)，Beyo Fast SYBR Green Qpcr Mix試劑盒(廣州碧云天生物技術(shù)有限公司)。Western-blot試劑：anti-DCC，稀釋度1∶2000、anti-MKK4，稀釋度1∶1000、anti-GAPDH，稀釋度1∶1000(美國(guó)Affinity公司)。免疫組織化學(xué)試劑：DCC兔源的單克隆抗體，稀釋度1∶250、MKK4兔源的單克隆抗體，稀釋度1∶200(武漢博士德生物公司)，DAB染色試劑盒(武漢博士德生物公司)，PBS(上海士鋒生物公司)。

3 研究方法 ①RT-PCR：組織總RNA提取，檢測(cè)RNA濃度及純度(A260/A280=1.8～2.0最佳)，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增條件95℃預(yù)變性5 min、95℃ 5 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s、40個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)：DCC：Forward 5'-CGGAGCAGGAAGAAGTCAGT-3'，Reverse5'-GCTTTTCCAGCCAACCCAAG-3';MKK4：Forward 5'-TCGGCTCTTCACTCCCAACA-3'，Reverse 5'-TCAACTTCAGTGCTTTGCGTT -3';GAPDH：Forward 5' -ATGATGATATCGCCGCGCTC-3'，Reverse 5' -GTACATGGCTGGGGTGTTGA-3'。②Western-blot：提取組織蛋白，蛋白充分變性后測(cè)濃度，Western-blot檢測(cè)不同組織中DCC、MKK4的表達(dá)情況，內(nèi)參選用GAPDH。③免疫組化：包埋、切片，脫蠟、染色、脫水、透明、封固(陰性對(duì)照以PBS代替第一抗體)。

4 結(jié)果判讀 ①RT-PCR:DCC、MKK4基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT法進(jìn)行定量分析。②Western-blot：應(yīng)用軟件Image J分析條帶灰度值。DCC蛋白相對(duì)表達(dá)量=DCC灰度值/GAPDH灰度值,MKK4蛋白相對(duì)表達(dá)量=MKK4灰度值/GAPDH灰度值。③免疫組織化學(xué)：DCC、MKK4蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞漿，其中出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景特異性著色者為陽(yáng)性細(xì)胞。光鏡下綜合考慮染色強(qiáng)度和陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)百分率記分進(jìn)行結(jié)果判斷[2]。按染色強(qiáng)度記分:0分為無(wú)色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。按陽(yáng)性染色細(xì)胞百分率記分,1分為11%～50%,2分為51%～75%,3分為>75%,兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果>3為陽(yáng)性(+)病例,≤3為陰性(-)病例。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)計(jì)分析。獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)或確切概率法，所有結(jié)果均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RT-PCR法檢測(cè)結(jié)直腸癌及癌旁組織中DCC、MKK4基因表達(dá)水平 結(jié)直腸癌組織中DCCmRNA、MKK4mRNA表達(dá)水平均低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 DCCmRNA、MKK4mRNA在結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平

2 Western-blot法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中DCC、MKK4蛋白表達(dá)水平 結(jié)直腸癌組織中DCC、MKK4蛋白表達(dá)均明顯低于癌旁組織(圖1)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 結(jié)直腸癌及癌旁組織中DCC、MKK4蛋白的表達(dá)情況

表2 DCC、MKK4蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)水平(灰度值)

3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)直腸癌及癌旁組織中DCC、MKK4蛋白表達(dá) DCC、MKK4蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿中，少數(shù)見(jiàn)于細(xì)胞核(圖2)。結(jié)直腸癌組織中DCC蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為20.0%,對(duì)應(yīng)癌旁組織中DCC蛋白表達(dá)陽(yáng)性率96.7%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);結(jié)直腸癌組織中MKK4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為28.3%,對(duì)應(yīng)癌旁組織中MKK4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率95.0%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);見(jiàn)表3。

表3 直腸癌及癌旁組織中DCC、MKK4蛋白表達(dá)比較[例(%)]

圖2 DCC、MKK4蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織的表達(dá)(Elivison法，×200)

4 結(jié)直腸癌組織中DCC、MKK4蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 DCC、MKK4蛋白表達(dá)水平均與腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤部位、大體形態(tài)、浸潤(rùn)深度等無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 結(jié)直腸癌組織中DCC、MKK4蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系

討 論

1 DCC與結(jié)直腸癌的關(guān)系 結(jié)直腸癌缺失基因(DCC),是一個(gè)重要的抑癌基因，于1990年被Fearon等[14]確認(rèn)并命名，定位于人染色體18q21.3,是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及生存的重要調(diào)節(jié)者，其表達(dá)產(chǎn)物p192是一種細(xì)胞黏附因子，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，可使細(xì)胞間具有較強(qiáng)的黏著性，限制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，因此DCC基因的缺失會(huì)減弱細(xì)胞之間的相互作用，造成細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)DCC基因在胃癌[15]、卵巢癌[16]、子宮頸癌[17]、子宮內(nèi)膜癌[18]中表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DCC基因在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平明顯降低，且其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明DCC為結(jié)直腸癌抑制基因，DCC基因表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，所以DCC基因可能成為結(jié)直腸癌患者早期診斷、治療及判斷預(yù)后的一個(gè)生物學(xué)標(biāo)志。

2 MKK4與結(jié)直腸癌的關(guān)系 絲裂原激活蛋白激酶4(MKK4)定位于人染色體17p11.2，可以編碼399個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。MKK4能通過(guò)激活核因子κB抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)磷酸化并激活JNK及p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化及凋亡等，其突變致下游底物磷酸化，從而放大MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)MKK4基因在肝癌[19]、卵巢癌[20]、肺癌[21]、鼻咽癌[22]中表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MKK4基因在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平明顯降低，且其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示MKK4為結(jié)直腸癌抑制基因，與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)，所以檢測(cè)MKK4基因的表達(dá)對(duì)判斷結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)測(cè)患者預(yù)后具有重要意義。