劉佳佳，于駿，謝冰，方杰，欒曉瑾，顏一丹

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

胎膜早破指的是胎膜在臨產(chǎn)前的破裂［1］，常伴隨多種并發(fā)癥，如絨毛膜羊膜炎、早產(chǎn)、腦癱等，早期精準(zhǔn)診斷是有效管理和預(yù)防并發(fā)癥的關(guān)鍵［2］。胎膜早破可由多因素引起，包括感染、吸煙、雙胎妊娠等［3-4］；炎癥—氧化應(yīng)激在造成胎膜損害的過程中起重要作用［4］。研究表明，局灶性感染和炎癥可能在胎膜早破的發(fā)病機(jī)制中起主要作用［5-6］。破膜部位的炎癥改變表明細(xì)菌感染可能是胎膜早破的啟動(dòng)者［6-7］。核因子 E2相關(guān)因子2（nuclear erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一種重要的抗炎介質(zhì)，限制炎癥反應(yīng)［8］。Nrf2通過抑制促炎細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-6）以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，但其在胎膜早破中的作用尚不完全清楚。本研究對(duì)胎膜早破患者胎膜組織中Nrf2表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析其與胎膜早破的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 研究對(duì)象選擇 本項(xiàng)研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，患者均知情同意。選取在2016年9月至2017年1月入住我院婦產(chǎn)科的30例健康孕婦（對(duì)照組）和30例胎膜早破孕婦（胎膜早破組）。其中，對(duì)照組平均年齡（26.43±2.67）歲，平均孕周（39.41±0.29）周；胎膜早破組平均年齡（27.47±2.79）歲，平均孕周（39.40±0.28）周；兩組年齡和孕周間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），具有可比性。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 胎膜早破的診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)產(chǎn)科學(xué)組制定的胎膜早破的診斷與處理指南（2015）［9］，在臨產(chǎn)前，產(chǎn)婦會(huì)感覺有大量陰道流液，有時(shí)可見胎脂或胎糞，進(jìn)行?？茩z查時(shí)可能會(huì)有多量的液體自宮頸口流出，陰道pH≥6.5，將陰道液涂于玻璃片上自然干燥，在顯微鏡下可觀察到羊齒狀結(jié)晶。

1.1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：均為第一次妊娠且足月，妊娠期在39周～39+6周之間，未臨產(chǎn)，單胎，胎位為頭位；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并糖尿病、高血壓、甲狀腺疾病、急性闌尾炎等內(nèi)外科疾病，胎兒窘迫或胎死宮內(nèi)、前置胎盤等胎兒及胎兒附屬物異常。

1.2 胎膜組織及主要試劑

胎盤胎膜娩出后，取胎膜破口處約4 cm×4 cm胎膜組織，生理鹽水沖洗表面血跡，將其均勻分成3份，其中2份置于凍存管放入液氮罐中備用，分別用于熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法；另1份立即行甲醛溶液固定，送至江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，石蠟包埋制成蠟塊，制作成5μm切片，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白引物序列：上游5′-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3′，下游5′-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3′；Nrf2引物序列：上游5′-TGAGGTTTCTTCGGCTACGTT-3′，下游5′-CTTCTGTCAGTTTGGCTTCTGG-3′。

RNA提取液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司）；熒光定量PCR試劑盒（上海Roche公司）；多克隆山羊抗人Nrf2抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司）；多克隆兔抗人Nrf2抗體（英國(guó)Abcam公司）；SP試劑盒（北京中杉金橋生物公司）。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)胎膜組織Nrf2 mRNA表達(dá)

按RNA提取液說明書提取胎膜組織總RNA，核酸測(cè)定儀測(cè)定各樣本RNA濃度，配制RNA終濃度為200 ng/μL；按說明書將各樣本總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系10μL，反應(yīng)條件：42℃ 60 min；70℃ 5 min。

PCR操作方法按照說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系25μL，2×濃度的反應(yīng)混合液12.5μL，7.5μmol/L上游引物和下游引物各1μL，cDNA 2.5μL，雙蒸水8μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火60 s；40個(gè)循環(huán)。以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量方法進(jìn)行分析，公式2-ΔΔCt計(jì)算 Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胎膜組織Nrf2蛋白表達(dá)

參考文獻(xiàn)［10］，提取胎膜總蛋白，測(cè)定總蛋白濃度；水浴變性；制備分離膠、濃縮膠，SDS-PAGE分離蛋白；濕轉(zhuǎn)法300 mA恒流30 min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；分別加1∶1 000稀釋的多克隆山羊抗人Nrf2抗體和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白，4℃孵育過夜；1×TBST洗膜3次；加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育30 min；1×TBST洗膜3次；發(fā)光劑熒光顯色，成像系統(tǒng)顯影；使用PhotoShop和Alpha軟件分析目標(biāo)帶的光密度值，并統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胎膜組織Nrf2的定位及表達(dá)

采用SP免疫組織化學(xué)法，其中陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。一抗多克隆兔抗人Nrf2抗體稀釋度1∶200，按SP試劑盒說明書操作。二甲苯脫蠟；枸櫞酸鹽緩沖液煮沸行抗原修復(fù)；3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶；山羊血清封閉液室溫孵育15 min；分別加入多克隆兔抗人Nrf2抗體和PBS，4℃孵育過夜；1∶200稀釋的羊抗兔IgG室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍片。

SP染色法陽性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒，陰性對(duì)照中無著色。參考文獻(xiàn)［11］免疫組織化學(xué)反應(yīng)評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)，染色強(qiáng)度：0分為無著色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：0分為＜1%，1分為1%～10%，2分為11%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%。染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞二者評(píng)分相乘計(jì)為總得分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎膜組織中Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)

胎膜早破組胎膜組織中Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組（t分別為-9.42，3.79，P＜0.01或P＜0.05），見圖1。

圖1 Nrf2 mRNA和蛋白在兩組胎膜組織中的表達(dá)

2.2 胎膜組織中Nrf2的定位及表達(dá)量

Nrf2在胎膜組織各層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均可見，其中，Nrf2在羊膜上皮層表達(dá)最高。與對(duì)照組相比，胎膜早破組的Nrf2在羊膜上皮層、絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞層和蛻膜層中表達(dá)明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2和表1。

3 討論

Nrf2對(duì)于炎癥的調(diào)節(jié)必不可少，在減輕炎癥中發(fā)揮重要作用［12-13］。Nrf2抗炎作用與其抑制促炎因子等相關(guān)［14］。研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下，Nrf2在胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用后經(jīng)蛋白酶體降解；在應(yīng)激狀態(tài)下，Keap1與Nrf2分離，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并激活細(xì)胞保護(hù)基因［15］。本研究結(jié)果顯示，Nrf2在胎膜組織各層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均可見，與Deshmukh等［15］研究結(jié)果基本一致，提示在胎膜組織各層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞中，穩(wěn)態(tài)及應(yīng)激狀態(tài)共存。由此推測(cè)，胎膜早破的發(fā)生可能由于穩(wěn)態(tài)與應(yīng)激狀態(tài)失衡。

圖2 光鏡下Nrf2在胎膜組織中的定位及表達(dá)

表1 兩組胎膜各層組織結(jié)構(gòu)的Nrf2免疫組化評(píng)分±s，分

表1 兩組胎膜各層組織結(jié)構(gòu)的Nrf2免疫組化評(píng)分±s，分

組別 羊膜上皮層 結(jié)締組織層 絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞層 蛻膜層 F值 P值.06 ＜0.01胎膜早破組 7.20±1.10 4.00±1.41 6.40±0.89 6.00±1.41 6.18 ＜0.01 t值對(duì)照組 11.40±1.34 6.00±2.12 10.20±1.64 9.60±2.51 7 5.42 1.75 4.54 2.79 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.05

Lim等［16］研究發(fā)現(xiàn)Nrf2在人胎膜中具有抗炎作用。本研究結(jié)果示胎膜早破組孕婦胎膜組織中Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，可能致其抗炎功能減弱，從而造成胎膜早破發(fā)生。本組健康孕婦和胎膜早破孕婦的胎膜組織中，羊膜上皮層Nrf2表達(dá)量均最高。已有研究表明，在炎癥刺激時(shí)，羊膜上皮層細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯高于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞層和蛻膜層，可能與羊膜上皮層的組織特異性有關(guān)［17］。由此表明，Nrf2在羊膜上皮層的高表達(dá)可能在胎膜早破中發(fā)病中起著至關(guān)作用。

綜上，Nrf2在胎膜組織中的表達(dá)水平降低可能與胎膜早破的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但并未對(duì)Nrf2如何影響胎膜早破具體機(jī)制進(jìn)行深入探討，后期將進(jìn)一步研究其中的關(guān)鍵分子及信號(hào)通路，以闡明其在胎膜早破發(fā)生發(fā)展中的作用。