王寧新，陳萍*，李堅(jiān)，呂夢佳，汪毅

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.呼吸內(nèi)科，2.中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212001）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的5年生存率不足20%［1］。及時(shí)發(fā)現(xiàn)并干預(yù)肺癌病灶，有助于降低肺癌患者死亡率，延長生存期。因此探尋高敏感性、高特異性的診斷NSCLC的生物標(biāo)志物依舊是肺癌防治領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為一種參與癌癥生物學(xué)的遺傳分子備受關(guān)注。多種lncRNA在腫瘤組織中異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)展過程［2］。已有研究表明，肺癌組織中l(wèi)ncRNA生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth arrest-specific transcript5，GAS5）的表達(dá)低于正常肺組織［3］，而lncRNA-CCAT1的表達(dá)則高于正常肺組織［4］。然而，關(guān)于這兩類lncRNA在血漿中的表達(dá)水平研究較少。本研究選取了NSCLC及良性肺病患者各60例作為研究對象，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血漿lncRNA-GAS5及l(fā)ncRNA-CCAT1的表達(dá)水平，分析其與相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討其用于診斷NSCLC的臨床價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年9月至2018年6月本院呼吸內(nèi)科住院NSCLC患者60例作為NSCLC組，其中男39例，女21例，年齡38～78歲；病理組織分型：肺腺癌39例，肺鱗癌21例。根據(jù)2017年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）肺癌TNM分期（第8版）標(biāo)準(zhǔn)，該組臨床分期Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期46例，另有10例臨床分期不能明確。NSCLC入選標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診；②均為新發(fā)病例，排除肺部轉(zhuǎn)移性腫瘤者，均未接受過手術(shù)、放療、化療或靶向治療。選取同期肺部良性疾病患者60例作為良性肺病組，其中男46例，女14例，年齡25～81歲，病種包括肺炎26例，慢性阻塞性肺疾病19例，支氣管擴(kuò)張15例。

為評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，另外選取20例健康人用于血漿lncRNA檢測結(jié)果的校對。本研究符合人體試驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者在收取標(biāo)本前均已閱讀并簽署知情同意書。

1.2 試劑及相關(guān)儀器

分離血漿RNA時(shí)使用美國Thermo SL 16R水平冷凍離心機(jī)、美國Thermo MICRO 21R高速冷凍離心機(jī)。血漿總RNA提取試劑為Trizol?Reagent（美國Invitrogen公司）。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA時(shí)使用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒（大連寶生物公司）、美國Bio-Rad Mycycler PCR儀。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒（大連寶生物公司）、美國Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3 血漿標(biāo)本的收集與處理

用無菌針管抽吸受試者全血4 mL，置于乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）抗凝試管中，TDL-S臺(tái)式低速離心機(jī)內(nèi)3 000 r/min離心10 min，提取血漿400μL，用1.5mL無RNA酶的EP管進(jìn)行分裝，長期凍存于超低溫冰箱（-80℃）。同時(shí)采集每位受試者2 mL的血液標(biāo)本送核醫(yī)學(xué)科檢測癌胚抗原及Cyfra21-1（試劑盒說明書標(biāo)明的癌胚抗原和Cyfra21-1正常上限分別為5μg/L和7μg/L）。

1.4 血漿RNA的提取及cDNA的合成

400μL血漿標(biāo)本冰面融化后，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒說明書提取血漿總RNA，濃度及純度使用U-2800紫外分光光度儀測定，收集的血漿總RNA可置于-80℃長期保存。取固定體積的血漿總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成的cDNA置于-20℃長期保存或者立即用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1的表達(dá)

取2μL cDNA作為模板，按照 TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒步驟配制熒光定量PCR反應(yīng)體系，最后在Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1的表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，隨后95℃ 5 s，60℃5 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本的每個(gè)檢測基因均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并根據(jù)熔解曲線判斷是否為特異性產(chǎn)物。選用GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算兩類lncRNA的相對表達(dá)量。使用的引物序列：

GAPDH上游引物為5′-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3′，下游引物為5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′；lncRNA-GAS5上游引物為5′-AGCAAGCCTAACTCAAGCCATTGG-3′，下游引物為5′-ATTAAGCTGGTCCAGGCAAGTTGG-3′；lncRNA-CCAT1上游引物為5′-TGCTCACCTTACTGCCTGAGC-3′，下游引物為5′-GGAGCGCACAACCTAGATCC-3′。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，組間比較使用levene法檢測方差齊性，方差齊時(shí)，使用t檢驗(yàn)；方差不齊，使用近似t檢驗(yàn)。使用受試者工作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）評估兩類lncRNA的診斷效能，各組數(shù)據(jù)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者血漿lncRNA-GAS5和lncRNACCAT1表達(dá)水平

與良性肺病組比較，NSCLC患者血漿中l(wèi)ncRNA-GAS5表達(dá)顯著下調(diào)（t=-5.379，P＜0.05），lncRNA-CCAT1表達(dá)水平明顯上調(diào)（t=5.721，P＜0.05）。見圖1。

圖1 非小細(xì)胞肺癌患者血漿lncRNA-GAS5與lncRNA-CCAT1表達(dá)水平

2.2 NSCLC患者血漿lncRNA-GAS5和lncRNACCAT1表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)資料，NSCLC患者血漿lncRNAGAS5表達(dá)水平與年齡、性別、組織分型以及臨床分期無關(guān)，但與吸煙史相關(guān)（P=0.013）；而lncRNACCAT1的表達(dá)與年齡、性別、吸煙史、組織分型以及臨床分期均無相關(guān)性（P均＞0.05）。見表1。

2.3 血漿 lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原、Cyfra21-1診斷NSCLC的效能比較

ROC曲線分析顯示，單獨(dú)檢測時(shí)，lncRNAGAS5、lncRNA-CCAT1的AUC分別為0.772（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.042，95%CI為0.690～0.855）和0.762（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.043，95%CI為0.678～0.846），而癌胚抗原、Cyfra21-1的AUC分別為0.737（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.045，95%CI為0.649～0.826）和0.735（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.045，95%CI為0.646～0.824），4種指標(biāo)的AUC無明顯區(qū)別（圖2a）。lncRNA-GAS5與lncRNA-CCAT1聯(lián)合診斷時(shí)的AUC為0.772（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.042，95%CI為0.690～0.854），與單獨(dú)檢測 lncRNA-GAS5的AUC相等，但高于單獨(dú)檢測lncRNACCAT1的AUC（圖2b）。

lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原三者聯(lián)合診斷時(shí)的AUC為0.870（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.032，95%CI為0.807～0.934），lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、Cyfra21-1三者聯(lián)合診斷時(shí)的AUC為0.840（標(biāo)準(zhǔn)誤為0.034，95%CI為0.772～0.908）。與單指標(biāo)及兩個(gè)指標(biāo)聯(lián)合診斷相比，聯(lián)合傳統(tǒng)標(biāo)志物后AUC提高，聯(lián)合癌胚抗原診斷的敏感性顯著升高。根據(jù)ROC曲線，找到診斷NSCLC的折點(diǎn)（cut off），并依此計(jì)算出敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準(zhǔn)確性。結(jié)果見表2。

圖2 血漿lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原、Cyfra21-1診斷NSCLC的ROC曲線

表2 血漿lncRNA-GAS5、lncRNA-CCAT1、癌胚抗原、Cyfra21-1對NSCLC的診斷效果

3 討論

lncRNA是一類結(jié)構(gòu)類似mRNA、長度大于200個(gè)核苷酸的不具有可讀框的轉(zhuǎn)錄本，可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、代謝和凋亡等生物學(xué)過程，在包括腫瘤等多種疾病發(fā)生中扮演重要角色［5-6］。近年來發(fā)現(xiàn)lncRNA在多種層面調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，并且lncRNA本身也可具有癌基因和抑癌基因的作用。一些lncRNA可在腫瘤中特異性表達(dá)，不同腫瘤可能具有不同的lncRNA表達(dá)譜［7-9］，因此lncRNA有可能作為包括肺癌在內(nèi)各種癌癥診斷和治療的靶點(diǎn)。

Huang等［10］用 RNA深度測序（RNA-seq）技術(shù)檢測外泌體中的RNA，結(jié)果顯示從血漿中分離獲得的外泌體中除有大量miRNA外，還有一些lncRNA（約占3.36%），這為外周血中存在lncRNA提供了直接依據(jù)。后續(xù)很多相關(guān)實(shí)驗(yàn)也再次驗(yàn)證了這個(gè)發(fā)現(xiàn)，如Zhang等［11］在乳腺癌患者及健康患者血漿中檢測到H19的表達(dá)，并證明其可作為乳腺癌早期篩查和預(yù)后監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物。楊哲峰等［12］的研究顯示，血漿lncRNA-HEIH的表達(dá)與肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈顯著正相關(guān)。上述研究均提示測定血漿中l(wèi)ncRNA對于肺癌的診斷具有可行性。

lncRNA-GAS5在乳腺癌、胃癌、前列腺等多種癌癥中下調(diào)［13-15］。有研究顯示［3］，肺癌組織中 lncRNA-GAS5的表達(dá)水平顯著低于正常肺組織，肺癌細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA-GAS5的表達(dá)水平明顯低于正常支氣管上皮細(xì)胞。Zhang等［16］亦發(fā)現(xiàn)，與鄰近正常組織比較，NSCLC組織中l(wèi)ncRNA-GAS5表達(dá)水平明顯降低；并且lncRNA-GAS5可抑制自噬，從而增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞中的順鉑敏感性。Liang等［17］的研究顯示，NSCLC患者血漿lncRNA-GAS5表達(dá)較健康者顯著降低，而術(shù)后第7天較術(shù)前明顯升高。Shi等［18］評估了lncRNA-GAS5表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性（主要為腫瘤分期及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），發(fā)現(xiàn)具有較高腫瘤負(fù)荷的較大腫瘤或更晚期的腫瘤中表達(dá)lncRNA-GAS5水平更加低下。上述研究表明，lncRNA-GAS5可能成為一個(gè)較好的診斷早期NSCLC的分子標(biāo)志物。當(dāng)然，lncRNA-GAS5并不是在所有的惡性疾病中都呈下調(diào)。有研究表明，血漿中l(wèi)ncRNA-GAS5表達(dá)水平的增加與多發(fā)性骨髓瘤密切相關(guān)［19］，這可能是由于不同疾病中l(wèi)ncRNA分泌途徑的差異所導(dǎo)致。

lncRNA-CCAT1最早于2012年在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)［20］，其在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)比在正常組織中高數(shù)倍，而其在染色體上位于轉(zhuǎn)錄因子c-Myc附近。但作為一種新型lncRNA，相關(guān)研究較少。Li等［21］發(fā)現(xiàn)lncRNA-CCAT1在57個(gè)胃癌組織樣本中的表達(dá)高于鄰近正常組織，并進(jìn)一步分析推測lncRNACCAT1通過負(fù)調(diào)節(jié)miR-219-1促進(jìn)胃癌發(fā)生和進(jìn)展。另外，lncRNA-CCAT1被證實(shí)在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)高于癌旁組織，其作用機(jī)制與c-Myc有關(guān)，同時(shí)lncRNA-CCAT1可作為“分子海綿”與miRNA let-7結(jié)合并拮抗其功能，最終促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲［22］。而在肺癌方面，White等［4］對 567例肺腺癌與肺鱗癌轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，經(jīng)綜合分析得到了肺癌中失調(diào)lncRNA圖譜，在異常表達(dá)的111種lncRNA中包括了CCAT1（在兩組肺癌細(xì)胞株中表現(xiàn)為高表達(dá)）。Lu等［23］發(fā)現(xiàn)香煙煙霧提取物能誘導(dǎo)lncRNACCAT1表達(dá)增加，而 lncRNA-CCAT1與miRNA let-7c競爭性結(jié)合降低了對其靶基因c-Myc的下調(diào)，而c-Myc又能反過來作用于lncRNA-CCAT1啟動(dòng)子區(qū)上調(diào)其表達(dá)，最終這種相互作用引起人類支氣管上皮細(xì)胞周期的改變，促進(jìn)支氣管肺癌的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與良性肺病患者比較，NSCLC患者血漿lncRNA-GAS5表達(dá)顯著下調(diào)，而lncRNA-CCAT1則表現(xiàn)為顯著上調(diào)。進(jìn)一步結(jié)合臨床資料分析顯示，NSCLC患者lncRNA-GAS5表達(dá)水平與年齡、性別、組織分型、分期無關(guān)，但與吸煙史相關(guān)（P=0.013），而lncRNA-CCAT1的表達(dá)與年齡、性別、吸煙史、組織分型、分期均無相關(guān)性。其次，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)檢測 lncRNA-GAS5及l(fā)ncRNA-CCAT1，其 AUC僅略高于癌胚抗原及Cyfra21-1，同時(shí)根據(jù)ROC曲線選取的折點(diǎn)處的敏感性均高于癌胚抗原及Cyfra21-1，但特異性略有不及。聯(lián)合檢測lncRNA-GAS5及l(fā)ncRNA-CCAT1時(shí)AUC無明顯改變，敏感性進(jìn)一步得到提升，特異性卻更加下降。高敏感性的標(biāo)志物更加適用于篩選試驗(yàn)，但診斷試驗(yàn)更注重高特異性，lncRNA-GAS5及l(fā)ncRNA-CCAT1聯(lián)合傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物時(shí)診斷效能增加，且敏感性得到明顯提升，特異性保持良好。因此，lncRNA-GAS5及l(fā)ncRNA-CCAT1有潛力與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，成為NSCLC患者篩選及診斷的分子標(biāo)志物。

本研究結(jié)果表明，在NSCLC患者及良性肺病患者血漿中l(wèi)ncRNA-GAS5及l(fā)ncRNA-CCAT1均呈差異性表達(dá)，但在分析這兩類基因表達(dá)與肺癌分期及肺癌病理分型關(guān)系時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性，單獨(dú)檢測或兩者聯(lián)合檢測用于診斷時(shí)的AUC與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物相比無明顯增加，與其他研究結(jié)果不符［17，21］?？紤]有以下幾個(gè)方面原因：①樣本量不足，可能存在抽樣誤差。②樣本相關(guān)特征分布不均：本研究中，大多數(shù)患者分布在Ⅲ期和Ⅳ期，Ⅰ和Ⅱ期僅4例，無法分析這兩個(gè)指標(biāo)能否在早期診斷NSCLC中發(fā)揮優(yōu)異表現(xiàn)。③臨床資料收集不完全：很多NSCLC患者不愿行相關(guān)檢查（如PET-CT），導(dǎo)致無法分期。④未考慮并發(fā)癥的影響：在閱讀相關(guān)文獻(xiàn)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA不僅與惡性疾病相關(guān)，同樣在良性疾病中也起重要作用，本研究的兩個(gè)基因也是如此，這更加對我們的研究添加了許多干擾因素。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將擴(kuò)大樣本量，注意挑選合適樣本，排除相關(guān)干擾因素，為進(jìn)一步證明血漿lncRNA-GAS5和lncRNA-CCAT1在NSCLC診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值提供更有說服力的證據(jù)。

綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示lncRNA-GAS5及l(fā)ncRNA-CCAT1在血漿中能夠被檢測，且在NSCLC患者和良性病變患者血漿中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這兩種基因在診斷NSCLC時(shí)具有一定的準(zhǔn)確性，聯(lián)合診斷時(shí)能獲得較高的敏感性。由于目前NSCLC的確診仍需依靠病理學(xué)結(jié)果，因此，我們認(rèn)為lncRNA-GAS5及l(fā)ncRNA-CCAT1聯(lián)合診斷能在NSCLC篩選試驗(yàn)中得到良好效果。