郁晶晶，卜妙然，孟令建，葉黎離，王軍

（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇徐州221002）

人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是先天性病毒感染最常見的病原體之一，新生兒及小嬰兒屬于免疫功能低下的群體，故容易感染HCMV。HCMV常引起多系統(tǒng)播散性疾病或單一組織、器官損害。HCMV肝損傷多見于嬰幼兒期原發(fā)感染者，是由遺傳、免疫和環(huán)境等多種原因所致，臨床上通常表現(xiàn)為黃疸、肝脾腫大、肝功能異常［1］。

目前，HCMV發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，可能與機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)。既往研究顯示，HCMV感染是多種細(xì)胞因子及細(xì)胞參與的慢性感染，病毒與機(jī)體間相互作用導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，而CD4+T細(xì)胞在此復(fù)雜的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的效應(yīng)。產(chǎn)生IL-17A的CD4+T細(xì)胞（helper T cells 17，Th17）和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+regulatory T cells，Treg）的發(fā)現(xiàn)打破傳統(tǒng)的Th1/Th2細(xì)胞效應(yīng)模式［2］。IL-35是一種新發(fā)現(xiàn)的抗炎因子，是Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用的重要成分。IL-35與Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞及IL-17等免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，通過多種途徑參與HCMV的發(fā)病與調(diào)節(jié)過程。

關(guān)于HCMV肝損后機(jī)體IL-17、IL-35和Th17/Treg水平變化及其臨床作用國內(nèi)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過檢測HCMV肝損傷組、非肝損組與健康對照嬰兒外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子，探討其在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用，為HCMV肝損傷的臨床治療探索新的方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至10月在本院兒科診斷為HCMV感染伴肝損傷的20例患兒為肝損傷組，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)感染消化學(xué)組制定的《巨細(xì)胞病毒感染診斷方案》［1］，經(jīng)PCR-DNA定量檢測尿液確診為HCMV病毒感染，均為初發(fā)未經(jīng)抗病毒及免疫抑制劑治療病例，臨床主要以黃疸、肝功能異常就診。患兒年齡52～337 d，平均（179±64）d，男 12例、女 8例；其中，5例表現(xiàn)為單純肝功能損害，9例為單純黃疸，2例為黃疸合并肝功能損害，4例肝功能損害合并肝大。

另外選取同期在年齡、性別分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的38例門診體檢嬰兒，其中存在HCMV感染但無肝損者18例作為非肝損組，20例體檢正常嬰兒且排除HCMV感染者為對照組。3組的年齡、性別構(gòu)成間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。所有入選者均排除膽道閉鎖、消化道畸形、其他類型病毒性肝炎（如甲、乙、丙肝炎病毒、EB病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒等感染所致的肝炎）、遺傳代謝性疾病、藥物性肝炎等。

受試嬰兒家長均簽署知情同意書，本研究通過醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

CD4-BB515抗體、APC-CD25抗體、PE-Foxp3抗體、IL-17A-PE抗體、白細(xì)胞激活劑組合、Transcription Factor Buffer Set購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；人IL-17、IL-35 ELISA試劑盒購自徐州康美生物科技有限公司；全自動(dòng)生化儀與免疫分析儀由我院檢驗(yàn)科提供；BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3 ELISA法檢測各組血清IL-17、IL-35濃度

采用EDTA抗凝管抽取實(shí)驗(yàn)對象外周血2 mL，3 000 r/min離心10 min，留取血清標(biāo)本分裝于EP管中，部分置-80℃冰箱凍存。按ELISA試劑盒說明書檢測IL-17和IL-35濃度。

1.4 血漿轉(zhuǎn)氨酶、尿HCMV-DNA載量檢測

上述EP管中部分血清采用全自動(dòng)生化儀測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平；留取測試者3次混合尿液，由我院中心實(shí)驗(yàn)室采用熒光免疫PCR法檢測尿HCMV-DNA載量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞比例

將上述剩余血標(biāo)本用等量PBS液稀釋后，加入淋巴細(xì)胞分離液1 500 r/min離心20 min，棄上清液，取外周血單核細(xì)胞（PBMC）與2μL白細(xì)胞刺激劑至24孔板，培養(yǎng)基吹勻細(xì)胞后，置于培養(yǎng)箱孵育4 h（37℃、5%CO2），取出離心，棄上清液，將管內(nèi)剩余物標(biāo)記，加入50μL PBS，用微量加樣儀混勻吹打管內(nèi)細(xì)胞，分別取2μL熒光標(biāo)記抗體（CD4-BB515抗體、APC-CD25）加入標(biāo)記為Treg管及Treg對照管，震蕩混勻后室溫避光孵育30 min；取1 mL PBS加入標(biāo)記為Th17管及Th17對照管內(nèi)，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加200μL甲醛于Th17對照管內(nèi)重懸，置4℃冰箱避光保存；Th17管中加1 mL細(xì)胞固定液重懸，室溫避光孵育40 min后，用Wash破膜劑固定，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，用1 mL緩沖液洗滌細(xì)胞2次；上述4組試管分別加入50μLWash破膜劑，將2μL PE標(biāo)記的IL-17 A抗體及2μL PE-Foxp3抗體置于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)試管，同型對照管加入同型對照抗體進(jìn)行染色，避光孵育50 min；各試管內(nèi)加1 mL緩沖液洗滌后1 500 r/min離心5 min，棄上清液，采用流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞比例，設(shè)同型對照用于校正補(bǔ)償。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，采用Pearson法對各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALT和尿HCMV-DNA定量

肝損傷組患兒外周血ALT明顯高于非肝損組和對照組（P均＜0.05），非肝損組和對照組間無明顯差別（P＞0.05）。熒光免疫PCR法檢測結(jié)果顯示，肝損組與非肝損組間HCMV-DNA含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 3組嬰兒丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和尿HCMV-DNA定量比較

2.2 外周血Th17細(xì)胞比例、Treg細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子濃度

與對照組比較，肝損傷組、非肝損組血清Th17細(xì)胞比例、IL-17濃度均明顯增高，肝損傷組這兩項(xiàng)指標(biāo)又顯著高于非肝損組（P均＜0.01）；肝損傷組、非肝損組外周血Treg細(xì)胞比例和IL-35濃度均明顯低于對照組，且肝損傷組又顯著低于非肝損組（P均＜0.01）。肝損傷組Th17/Treg明顯高于非肝損組和正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。見表2和圖1。

表2 各組嬰兒外周血Th17、Treg細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子濃度比較±s

表2 各組嬰兒外周血Th17、Treg細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子濃度比較±s

a：P＜0.05，與非肝損傷組比較；b：P＜0.05，與對照組比較

組別 n IL-17（pg/mL） IL-35（pg/mL） Th17細(xì)胞（%） Treg細(xì)胞（%）Th17/Treg肝損傷組 20 268.22±2.82a，b 41.73±6.02a，b 42.61±5.24a，b 3.59±0.61a，b 12.25±2.77a，b 75.828 28.347 47.209 40.472 39.43 P值非肝損組 18 217.48±1.58b 47.68±4.48b 32.91±5.98b 4.41±0.77b 7.60±1.67b對照組 20 182.62±1.98 57.02±8.18 26.90±4.17 6.65±1.01 4.11±0.70 F值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血Th17細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞比例

2.3 相關(guān)性分析

外周血Treg細(xì)胞比例與IL-35濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.620，P＜0.05）；外周血 Th17細(xì)胞比例與血清 IL-17濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.830，P＜0.05）。

3 討論

肝臟是人體的重要靶器官，容易受外界環(huán)境、機(jī)體內(nèi)部免疫紊亂的影響而發(fā)生病變。HCMV侵犯肝膽管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞后，經(jīng)抗原提呈和白細(xì)胞黏附作用，促使多種細(xì)胞參與機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重肝臟損害［3-4］。

Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種輔助細(xì)胞，維甲酸相關(guān)孤兒受體 ROR-γt是其主要轉(zhuǎn)錄因子。Th17細(xì)胞主要由胸腺合成，部分為TGF-β和IL-6誘導(dǎo)T細(xì)胞前體分化而成。Th17細(xì)胞通過分泌IL-17、IL-22及IL-23等效應(yīng)因子參與炎癥反應(yīng)、防御胞外病原菌感染［5］。IL-17主要啟動(dòng)T細(xì)胞誘導(dǎo)的早期炎癥反應(yīng)，參與免疫調(diào)節(jié)并發(fā)揮較強(qiáng)的炎癥介導(dǎo)功能［6］。研究表明，IL-17R是同源信號(hào)I型跨膜蛋白質(zhì)受體，與IL-17結(jié)合后可促使產(chǎn)生IL-8和GRO-α，激活MAP激酶磷酸化等多種下游途徑［7］，同時(shí)招募大量的炎癥細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞的激活。HCMV可激發(fā)相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，募集、活化中性粒細(xì)胞，同時(shí)刺激Th17細(xì)胞分泌IL-17，參與肝臟炎癥反應(yīng)［8-9］。Yasumi等［10］曾提出 IL-17可作為肝臟急性損傷的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)中，ELISA檢測結(jié)果顯示HCMV肝損患兒外周血中IL-17濃度顯著高于另外兩組，與孫曉紅等［3］的研究結(jié)果一致。因此我們認(rèn)為IL-17可作為衡量HCMV肝損患兒的重要指標(biāo)。

Treg細(xì)胞是機(jī)體負(fù)向免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答的重要細(xì)胞亞群，在病毒感染過程中通過產(chǎn)生高濃度IL-10和TCF-β等細(xì)胞因子，抑制T淋巴細(xì)胞及NK等細(xì)胞的增殖分化。IL-35是一種新型的抗炎細(xì)胞因子，2007年 Niedbala等［11］以及 Collison等［12］的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步顯示，IL-35主要由Treg細(xì)胞分泌。IL-35一方面刺激Treg細(xì)胞增殖，另一方面誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有更強(qiáng)抑制活性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞［13］，構(gòu)成機(jī)體強(qiáng)大的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

既往研究顯示IL-35在骨髓增生異常綜合征、乳腺癌、心血管等疾病中發(fā)揮重要作用。萬雪媛等［14］在小鼠模型實(shí)驗(yàn)中提出，在MCMV感染急性期IL-35可抑制炎癥反應(yīng)，而在急性感染所致的持續(xù)病理損傷過程中發(fā)揮著重要保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCMV感染肝損傷患兒Treg細(xì)胞比例與IL-35濃度明顯下降。因此，我們猜測Treg細(xì)胞、IL-35可能在HCMV感染中發(fā)揮重要免疫保護(hù)作用。

本研究顯示，HCMV肝損患兒Treg細(xì)胞比例較對照組下降，Th17/Treg平衡被打破，IL-17促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展，并在肝臟代謝中產(chǎn)生重要反應(yīng)，從而形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞都來源于CD4+T細(xì)胞，既往研究證實(shí)Treg細(xì)胞在高濃度IL-6的刺激下可轉(zhuǎn)化成Th17細(xì)胞；另外，Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3與ROR-γt結(jié)合，可抑制IL-17 RNA的轉(zhuǎn)錄，從而影響Th17細(xì)胞的功能［15］。所以，Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞在分化及免疫應(yīng)答方面存在相互拮抗作用。Th17細(xì)胞主要參與肝臟炎癥反應(yīng)，而Treg細(xì)胞主要在慢性病毒感染中表達(dá)。有人提出，當(dāng)出現(xiàn)重型肝炎時(shí)，機(jī)體Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17濃度可顯著增加，參與炎癥反應(yīng)致肝臟損傷；相應(yīng)地Treg細(xì)胞分化增強(qiáng)，下調(diào)免疫反應(yīng)從而避免肝臟過度損傷［16］；所以，Th17、Treg細(xì)胞在維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。IL-35能促進(jìn)IFN-γ合成，并抑制Th17細(xì)胞增殖分化，減少IL-17的分泌，從而抑制機(jī)體過度的免疫損傷［17］。

綜上所述，在巨細(xì)胞病毒肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，存在多種細(xì)胞及細(xì)胞因子的參與。以IL-17為主的促炎因子和IL-35為主的抗炎介質(zhì)引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，Th17/Treg的平衡在維持機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用。IL-35是一種具有潛在治療前景的新型調(diào)節(jié)因子，能否通過提高IL-35濃度來抑制炎癥反應(yīng)有待探討；相信隨著對IL-35與HCMV關(guān)系的深入了解，IL-35在慢性病毒感染中將展現(xiàn)臨床應(yīng)用前景。