梁麗莉 ，王柳萍 ，林忠秋 ，黃光明 ，譚承梅 ，楊 斌 ，黃興振 △

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530299；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000）

藿夏膠囊源于民間驗方，主要由淫羊藿、夏枯草等中藥提取物組方。方中淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.多用于高血壓、乳房腫塊等癥的臨床治療。淫羊藿苷抗腫瘤作用顯著，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進細(xì)胞凋亡及增強機體免疫力等[1]。夏枯草Prunella vulgarisL.為唇形科雙子葉植物夏枯草的干燥果穗，有軟堅散結(jié)、清火明目功效[2]。本課題組前期開展的安全性和藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，在藿夏膠囊治療劑量下，試驗動物多項生理指標(biāo)及臨床檢驗指標(biāo)均未顯示出毒性反應(yīng)。血清藥理學(xué)試驗結(jié)果表明，其含藥血清對人大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞的抑制率24 h時達65.7%，48 h時達68.84%（P<0.01）。為建立藿夏膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究中采用正交試驗法優(yōu)選其提取工藝并確定成型工藝，為該制劑提供合理的提取和制劑成型方案。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；H2050R型醫(yī)用離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；101-1型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（紹興道墟浦鴻烘箱電爐廠）；AL-104型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司）；BJ-800A型多功能粉碎機（湖州德清拜杰電器有限公司）；YPGSD250型綜合藥品穩(wěn)定性試驗箱（上海蘇盈試驗儀器有限公司）。

1.2 試藥

淫羊藿、夏枯草藥材（北海天洄技術(shù)有限公司），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王柳萍教授鑒定為正品；淫羊藿苷對照品（批號為110737-201516，含量為95.0%)、迷迭香酸對照品（批號為 111871-201505，含量為95.0%），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，稀乙醇、三氟乙酸均為分析純，硬脂酸鎂、可溶性淀粉、糊精、磷酸鈣等均為藥用輔料級，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝

2.1.1 吸水率試驗

稱取處方量藥材（70.5 g，m1），加 12 倍量水，分別浸泡 30，60，90，120，150，180 min 后濾過蒸干，并稱定藥材質(zhì)量(m2)。按公式W=（m2-m1）/m1×100%計算藥材的吸水率。結(jié)果藥材的吸水率為處方量的3倍。

2.1.2 含量測定

溶液制備：稱取處方量藥材（70.5 g），加3倍量水，浸泡30 min，回流提取，合并濾液，1 000 r/min離心10 min，減壓抽濾，濃縮定容至250 mL，60℃烘干粉碎，得供試品，以水溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，置4℃保存，備用。取淫羊藿苷、迷迭香酸對照品各適量，分別加甲醇溶解，即得單一對照品溶液。

淫羊藿苷含量測定：色譜條件為色譜柱JADE-PAK ODS柱（250 mm×4.6mm，5μm），流動相乙腈-水（30∶70，V/V），流速 1 mL/min，檢測波長 270 nm，柱溫 30℃，進樣量10 μL。取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y1=0.000 013 22X1-0.064 32（r=0.999 3）。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在0.1～5.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。取對照品溶液、供試品溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計大于6 000，分離度不小于1.5，基線分離良好。按標(biāo)準(zhǔn)進行精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、加樣回收試驗，結(jié)果日內(nèi)、日間精密度試驗的RSD分別為1.07%和1.36%（n=6），穩(wěn)定性試驗的RSD為0.44%（n=5），供試品溶液室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定；加樣回收率為98.70%～100.50%，RSD為 1.48%（n=6）。

迷迭香酸含量測定：色譜條件為色譜柱JADE-PAK ODS-AQ 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相甲醇 -0.1%三氟乙酸溶液（42 ∶58，V/V），流速 1 mL/min，檢測波長330 nm，柱溫35℃，進樣量10 μL。取迷迭香酸對照品適量，加稀乙醇制成不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y2=0.000 015 00X2+0.114 9（r=0.999 4）。結(jié)果表明，迷迭香酸質(zhì)量濃度在0.5～10.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。取對照品溶液、供試品溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果理論板數(shù)按迷迭香酸峰計大于6 000，分離度不小于1.5，基線分離良好。按標(biāo)準(zhǔn)進行精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、加樣回收試驗，結(jié)果日內(nèi)、日間精密度試驗的RSD分別為1.34%和1.57%（n=6）；穩(wěn)定性試驗的RSD為 0.84%（n=6），供試品溶液室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定；加樣回收率為99.30%～101.40%，RSD為1.15%（n=6）。

樣品含量測定：取供試品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，平行3次，記錄峰面積并計算含量。

2.1.3 干膏率測定

取供試品溶液100 mL，置蒸發(fā)皿中，80℃水浴鍋蒸干水分，100～105℃烘箱中干燥3 h，移至干燥器中，放冷30 min，取干膏，精密稱定，按公式W1=m干膏/m生藥×100%計算供試品的干膏率（%），式中W1為干膏率，m為質(zhì)量。

2.1.4 單因素分析

參照文獻[3-5]，對藥材提取影響較大的因素為提取時間、提取次數(shù)和提取水量，故分別對其做單因素分析。選擇3個因素最佳的3個水平，提取時間分別為 1.0 h，1.5 h，2.0 h，提取水量分別為 10 倍，12 倍，14倍，提取次數(shù)分別為1次，2次，3次。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.5 正交試驗

以提取時間（因素 A）、提取水量（因素 B）、提取次數(shù)（因素 C）為 3因素，采用L9（34）正交試驗法優(yōu)選提取工藝。以淫羊藿苷含量（F1）、迷迭香酸含量（F2）及干膏率（F3）的綜合評分作為指標(biāo)[6-7]，三者的權(quán)重系數(shù)分 別 為 0.3，0.3，0.4。綜 合 評分 =（F1×0.3+F2×0.3+F3×0.4）×100%。因素與水平見表 1，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。可見，3個因素對有效成分的提取率均無顯著影響。直觀分析結(jié)果表明，影響水提效果強度的因素依次為提取次數(shù)>提取時間>提取水量。得提取工藝最優(yōu)條件為A3B1C3。即10倍量水（首次為13倍）提取3次，每次2 h。

表1 因素與水平

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.2 成型工藝

2.2.1 流動性考察

采用固定漏斗法測定[8]，平行3次。結(jié)果供試品的休止角平均值為45.5°(>40°)，提示流動性不佳，不適合直接裝填于空膠囊中。

2.2.2 填充劑種類

供試品黏性大，制粒困難，易吸濕，故需添加適宜的填充劑[9]。本試驗中選用的填充劑分別為糊精、可溶性淀粉、硬脂酸鎂和磷酸鈣，供試品與各填充劑比例均為1∶3（m/m），50%乙醇制軟材后過14目篩制粒，60℃干燥。以軟材質(zhì)量、顆粒狀態(tài)為指標(biāo)進行考察。結(jié)果以磷酸鈣作為填充劑時制得的軟材質(zhì)量好，顆粒成型性佳，故以其為填充劑制粒。

2.2.3 填充劑比例

在填充劑種類相同的前提下，填充劑比例的不同可造成制得顆粒成型性出現(xiàn)差異。將供試品與磷酸鈣分別按 1 ∶2，1 ∶3，1 ∶4，1 ∶5（m/m）的比例混合[10]，50%乙醇制軟材后過14目篩制粒，60℃干燥。以軟材質(zhì)量、顆粒狀態(tài)為指標(biāo)進行考察。結(jié)果當(dāng)提取物與磷酸鈣的比例為1∶4時（m/m），所制得的軟材質(zhì)量好，顆粒成型性佳，故選擇供試品與磷酸鈣的混合比例為1∶4（m/m）。

2.2.4 潤濕劑體積分?jǐn)?shù)

在不使用黏合劑的情況下，潤濕劑直接影響顆粒的質(zhì)量[11]。供試品與磷酸鈣按1∶4（m/m）混合后，加入相同體積而體積分?jǐn)?shù)不同的乙醇作為潤濕劑。通過制粒情況、干燥后顆粒狀態(tài)和相對濕度為50%時的吸濕率等指標(biāo)對乙醇體積分?jǐn)?shù)進行考察。結(jié)果見表4?？梢?，乙醇體積分?jǐn)?shù)對吸濕性影響不大，但體積分?jǐn)?shù)越高，含水量越少，顆粒越散，成型性越差。乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時制粒情況最好，故本試驗中選用50%乙醇作為潤濕劑。

表4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察結(jié)果

表5 乙醇用量的考察結(jié)果

2.2.5 潤濕劑用量

根據(jù)濕法制粒“握之成團、觸之即散”的經(jīng)驗原則操作。供試品與磷酸鈣以1∶4（m/m）混合后，分別以表5中不同比例的50%乙醇作為潤濕劑，通過制粒情況、休止角、干燥后顆粒狀態(tài)和相對濕度為50%時的吸濕率等指標(biāo)對潤濕劑乙醇的用量進行考察，結(jié)果見表5。可見，當(dāng)供試品與乙醇潤濕劑的比例為1∶0.48(m/V，g/mL)時制得的顆粒均勻，休止角小于40°，流動性較好，相對濕度為50%時吸濕率最低，故本試驗中選用原料與乙醇的比例為1∶0.48(m/V)。

2.2.6 顆粒干燥溫度

干燥溫度也是影響顆粒成型質(zhì)量的關(guān)鍵因素。取3份用上述方法制得的等量顆粒（30 g），分別置40，60，80℃恒溫干燥箱干燥1 h，以顆粒狀態(tài)、顆粒含水量為指標(biāo)確定最適干燥溫度，水分含量要求符合2015年版《中國藥典（四部）》通則 0103“膠囊劑”項下規(guī)定[12]。結(jié)果干燥溫度為60℃時，顆粒無黏連，含水量為5.64%。

2.2.7 顆粒臨界相對濕度（CRH）[13]

分別取若干份同等質(zhì)量的供試品和顆粒，干燥至恒重后轉(zhuǎn)入恒重稱量瓶內(nèi)，平鋪于底部，分別放入恒溫25℃，相對濕度分別為40%，50%，60%，70%，80%，90%的藥物試驗穩(wěn)定箱中，12 h后取出，精密稱定，計算吸濕百分率，以相對濕度為橫坐標(biāo)、顆粒吸濕百分率為縱坐標(biāo)，作不同濕度條件下顆粒吸濕率的曲線圖，用切線法求得CRH。結(jié)果見圖2。在相同條件下，顆粒的吸濕率總是低于粉末的吸濕率，供試品與填充劑混合制成顆粒后吸濕性降低。由顆粒兩端點的切線方程求得顆粒CRH為63.83%。因此在實際生產(chǎn)過程中，車間環(huán)境相對濕度應(yīng)控制在該值以下。

2.2.8 顆粒堆密度測定

采用量筒法[14]。將制得的干燥顆粒緩慢加入干燥至恒重的10 mL量筒中，顆粒加至約9.6 mL，記錄體積并稱定總質(zhì)量，精密稱定，計算顆粒堆密度，平行操作6次。結(jié)果顆粒的堆密度為0.440 g/mL。

圖2 浸膏粉末與顆粒的吸濕性對比

2.2.9 空膠囊的規(guī)格選擇[15]

民間驗方的干膏用量應(yīng)為每天1.2 g，結(jié)合顆粒的堆密度和填充劑的比例，按公式膠囊殼的可裝量=顆粒的堆密度×膠囊殼的容積計算，本試驗確定膠囊每粒裝0.33g，每天3次，每次6粒，故本試驗中選用0號膠囊殼。

3 討論

中藥材多需經(jīng)過炮制，且藥材本身密度大，炮制后縫隙多，易吸水，為提高加液量的準(zhǔn)確性，需確定藥材本身的吸水率，故進行吸水性試驗[16]。由本試驗結(jié)果可知，該處方自身的吸水率為處方量的3倍，故首次提取需加13倍量水。

藿夏提取物多為糖類和黃酮類，黏性大，流動性不佳，制粒困難，故需加入適當(dāng)?shù)妮o料使其容易制粒。通過對休止角、吸濕性和顆粒成型性的考察發(fā)現(xiàn)，磷酸鈣可提高供試品吸濕性，因此選擇磷酸鈣作為輔料。與淀粉等輔料不同的是，磷酸鈣作為脆性物料，其吸濕后可以形成結(jié)晶水，不會在很大程度上影響主藥的形態(tài)，不僅利于主藥的長期保存，同時也能使主藥具有良好的成型性。

CRH可用于設(shè)定生產(chǎn)和貯存時的濕度范圍，從而限制環(huán)境中水分對固體制劑的影響。經(jīng)測定，顆粒的CRH為63.83%，因此，膠囊成型的環(huán)境相對濕度應(yīng)控制在該值以下，防止顆粒吸濕而潮解導(dǎo)致藥物降解變質(zhì)，從而影響藥物的療效并減少不良反應(yīng)。

綜上所述，該工藝合理可行，所制得顆粒成型較好。