張競(jìng)之，鄧波，江小梨，張雙偉，蔡敏，鄧穗暉，陳瑞雪，劉彬

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510260；2.廣州醫(yī)科大學(xué)中西結(jié)合研究所，廣東 廣州 510260

肝癌是我國最常見的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率高、死亡率高，目前針對(duì)肝癌治療的藥物效果有限，探索新型有效的抗肝癌藥物的研發(fā)具有重要意義[1]。10-姜酚（10-Gingerol，10-G）是生姜的主要成分之一。研究表明生姜中的姜酚類化合物具有抗腫瘤、抗炎、止嘔、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，姜酚類成分抗腫瘤作用及其機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)[2]。原癌基因酪氨酸激酶ABL1（Protooncogene tyrosine-protein kinase ABL1，ABL1）屬于非受體蘇氨酸蛋白激酶家族，是調(diào)控腫瘤的血管生成、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，包括有慢性粒細(xì)胞白血病、乳腺癌、胃癌、肝癌等[3]。本研究將采用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究10-G對(duì)ABL1蛋白激活的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

中藥對(duì)照品10-姜酚購自成都曼思特生物科技有限公司（純度＞99.04%，貨號(hào)：MUST-17033004，批號(hào)：23513-15-7）。胎牛血清購自BI公司。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司。BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯影劑購自美國Thermo公司。抗p-ABL1、ABL-1抗體購自美國Affinity公司，抗GAPDH抗體購自美國CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 mg/mL）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃，5%CO2以及飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞生長呈80%-90%融合狀態(tài)時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每2～3 d傳代一次。

1.3 分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬

使用AutoDock軟件分析10-G與ABL1之間的關(guān)系。從PDB數(shù)據(jù)庫獲得ABL1（PDB ID：2HZI）的空間結(jié)構(gòu)。從ZINC數(shù)據(jù)庫取得10-G（ZINC ID：ZINC43009609）的3D分子結(jié)構(gòu)。采用分子對(duì)接軟件Autodock VINA進(jìn)行分子對(duì)接模擬。用ABL1與已知的ABL1抑制劑PD180970的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)10-G與ABL1之間的關(guān)系。將10-G與ABL1進(jìn)行分子對(duì)接，采用結(jié)合力評(píng)估結(jié)合能力的大小。采用Pymol 2.7軟件進(jìn)行3D作圖。采用YASARA進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，將ABL1與10-G之間的最佳構(gòu)象作為初始構(gòu)象。在AMBER03力場(chǎng)中進(jìn)行模擬。將蛋白結(jié)構(gòu)置于立方體中，立方體邊緣與蛋白質(zhì)最小距離為5 ?，以0.9%的NaCl作為溶劑。在分子動(dòng)力學(xué)模擬之前，對(duì)每個(gè)體系進(jìn)行能量最小化，采用2 000步的最小化法和2 000步的共軛梯度法。然后利用Berendsen熱浴控制每個(gè)分子的溫度。最后，進(jìn)行100 ns，步長為2 fs的分子動(dòng)力學(xué)模擬。

1.4 Wesltern Blot檢測(cè)

Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。60 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，PBS漂洗后收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解，提取總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，1×TBST液洗滌3次，每次7分鐘，加入二抗，37℃孵育1h，1×TBST液洗滌3次，每次7分鐘。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，膠片曝光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD），重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析（Repeated measures data of ANOVA），多組比較采用單因素方差（One-Way ANOVA），若方差齊性，各組間多重比較采用LSD法（Least-significant difference test），若方差不齊時(shí)，采用Welch穩(wěn)健估計(jì)，再采用Dunnett's T3方法兩兩比較。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 10-G與ABL1的分子對(duì)接

采用分子對(duì)接方法評(píng)價(jià)ABL1與10-G之間的關(guān)系。ABL1與10-G的結(jié)合力為-7.96 kcal/mol。ABL1與10-G的結(jié)合構(gòu)象見圖1，10-G與ABL1的氨基酸殘基GLU-305形成氫鍵連接，氫鍵的長度為2.1 ?。

2.2 10-G與ABL1復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬

圖1 10-G與ABL1分子對(duì)接模擬Figure 1 Molecular docking simulation investigated the interaction between 10-G and ABL1

我們進(jìn)一步采用分子動(dòng)力學(xué)技術(shù)探索ABL1與10-G結(jié)合的穩(wěn)定性。ABL1-10-G復(fù)合物的表面模擬模型見圖2A-B，圖2A為0ns時(shí)的結(jié)合構(gòu)象，圖2B為第100 ns的結(jié)合模型。經(jīng)過100 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，10-G仍位于ABL1的抑制劑結(jié)合位點(diǎn)。圖2C展示了重原子均方根偏差（Root-meansquare deviation，RMSD）的變化軌跡。ABL1-10-G復(fù)合物的RMSD圍繞2 ?波動(dòng)，非結(jié)合狀態(tài)ABL1在前60 ns上升至4.5 ?后，逐漸降低并波動(dòng)在3.9 ?。圖2D展示了非結(jié)合狀態(tài)ABL1以及ABL1-10-G復(fù)合物勢(shì)能的變化軌跡，ABL1-10-G復(fù)合物的勢(shì)能高于非結(jié)合狀態(tài)的ABL1。

2.3 10-姜酚抑制肝癌細(xì)胞ABL1磷酸化水平

我們將10-G（10、20、30μM）處理肝癌HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，Western blot檢測(cè)p-ABL1、ABL1、GAPDH的表達(dá)。結(jié)果見圖3，低、中、高的10-G顯著降低肝癌細(xì)胞p-ABL1的表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001）。

3 討論

圖2 ABL1-10-G復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬Figure 2 Molecular dynamics simulation of ABL1-10-G complex

圖3 10-G抑制HepG2細(xì)胞中ABL1的激活Figure 3 10-G inhibited the activation of ABL1

10-G屬于姜酚類化合物，現(xiàn)代藥物藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，姜酚具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抗炎等作用[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)10-G具有抗黑色素瘤的作用[5]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)10-G能抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖[6]，誘導(dǎo)乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞[7]以及結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞[8]的凋亡。然而，10-G抗腫瘤的機(jī)制尚不完全清楚，本研究對(duì)10-G的抗腫瘤機(jī)理進(jìn)行探索。

ABL1是一種非受體酪氨酸激酶，存在于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中，具有調(diào)節(jié)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及血管新生的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)ABL1能調(diào)控有絲分裂激酶調(diào)節(jié)器PLK1的磷酸化，從而抑制PLK1的泛素化與降解，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的增殖[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，ABL1具有調(diào)控PDGF誘導(dǎo)的腫瘤的遷移的作用，其機(jī)制可能于調(diào)控αvβ3整合素有關(guān)[11]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)ABL1能介導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）誘導(dǎo)的腫瘤血管新生[12]。因此，ABL1是腫瘤研究的重要靶點(diǎn)之一，針對(duì)ABL1抑制劑具有良好的開發(fā)前景。

近年來，分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)及篩選中，可以顯著的提高藥物開發(fā)的精準(zhǔn)度和效率。本研究通過分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)10-G與ABL1進(jìn)行對(duì)接來預(yù)測(cè)復(fù)合物模型，分析表明10-G與ABL1之間具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。我們還進(jìn)一步采用了分子動(dòng)力學(xué)技術(shù)對(duì)10-G與ABL1結(jié)合的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示10-G與ABL1的結(jié)合是穩(wěn)定的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證10-G與ABL1之間的關(guān)系，我們觀察了10-G對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞ABL1激活的影響。結(jié)果顯示，10-G能顯著抑制ABL1的激活。此外，ABL1已被證實(shí)在白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌中起了重要作用[9]。這提示10-G可能具有防治這些腫瘤的潛力。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)10-G可能是一個(gè)潛在ABL1抑制劑，其抗腫瘤作用與抑制ABL1密切相關(guān)。本次研究結(jié)果提示抑制ABL1可能是10-G及姜酚抗肝癌的新靶點(diǎn)。