羅歡 孫昀 余維麗 薛彬華 劉 昂 劉 奕

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，合肥230038)

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是一種原發(fā)胰腺、但可能會累及全身且危及生命的疾病，全球發(fā)病率逐年上升[1]。重癥AP的特點是急性發(fā)作，病情復(fù)雜，預(yù)后差，并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率高，病死率高達(dá)30%[2,3]。目前認(rèn)為多種因素均可導(dǎo)致這一疾病發(fā)生，主要有膽源性和酒精性因素[4]。近年高甘油三酯血癥也被認(rèn)為是AP的一個重要發(fā)病原因，已有研究發(fā)現(xiàn)近年來高甘油三酯血癥為主要誘因的AP患者比例由1%上升至10%[5]。高脂血癥重癥急性胰腺炎(Hyperlipidemic severe acute pancrea-titis，HLSAP)的發(fā)病年齡比其他AP患者小，易反復(fù)發(fā)作，組織損傷更嚴(yán)重[6]。高脂血癥性胰腺炎(Hyperlipidemic acute pancreatitis，HLAP)的發(fā)病機(jī)制研究是當(dāng)前急性胰腺炎研究領(lǐng)域的難點和熱點。MicroRNA是一種微小的、非蛋白質(zhì)編碼的單鏈RNA，在正常組織和癌癥中通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)，越來越多的證據(jù)表明MicroRNA參與了包括細(xì)胞發(fā)育、凋亡和自噬在內(nèi)的一系列過程[7]。miR-141已被證實可與高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein，HMGB1)的mRNA上結(jié)合位點相結(jié)合從而抑制其表達(dá)，進(jìn)而在急性胰腺炎的發(fā)病過程中起到重要作用[8]。但在HLAP患者體內(nèi)miR-141與HMGB1及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況目前尚未得到驗證，故本實驗就HLAP患者血標(biāo)本中的miR-141及HMGB1等表達(dá)情況及其與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系進(jìn)行初步探究，闡釋其在HLAP發(fā)病過程中的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1資料與分組 選取2016年1月至2018年1月期間入住我院ICU并且臨床診斷為高脂血癥中重癥急性胰腺炎(Hyperlipidemic moderately severe acute pancreatitis，HLMSAP)及HLSAP患者各30例，其一般資料見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具有急性胰腺炎的臨床表現(xiàn)，HLMSAP及HLSAP診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2012年急性胰腺炎亞特蘭大分類標(biāo)準(zhǔn)修訂[9]；②甘油三酯濃度≥11.3 mmol/L，或濃度在5.65～11.3 mmol/L范圍內(nèi)且血清呈乳糜狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除膽源性、酒精性等引起AP的其他致病因素；②伴有心、肝、肺、腎等其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病的患者。對照組(NC)取同期我院體檢中心30例體檢結(jié)果健康人群血液樣本。三組患者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本項目經(jīng)我院倫理委員會通過。

1.1.2儀器與試劑 Ez Omics One-Step qPCR試劑盒、miRNA qRT-PCR Kit試劑盒(蘇州GenePharma公司)；TRIzol試劑、SYBR PremixExTapⅡ(5×)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；引物由上海生物工程有限公司合成；Western blot相關(guān)蛋白HMGB1、Beclin-1、LC3和Actin的一抗( 武漢博士德生物工程有限公司)；相關(guān)的二抗山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG、RIPA裂解液(湖南碧云天股份有限公司)。80-2離心機(jī)(常州榮華公司，中國)；Step One PCR擴(kuò)增儀(ABI公司，美國)；Tanon EPS300電泳機(jī)(上海天能科技有限公司，中國)；分光光度儀(Implen Gmb H公司，德國)；TU-100恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司，中國)；MK3酶標(biāo)儀(雷勃公司，荷蘭)。

1.2方法

1.2.1生化指標(biāo)檢測 抽取全部患者入院第2天的空腹靜脈血，由我院檢驗科檢測降鈣素原(Procalcitonin，PCT)、IL-6等指標(biāo)，見表1。

1.2.2樣本采集與處理 收集所有患者及健康人納入研究時的血液標(biāo)本4 ml，抗凝處理后，高速離心去除血漿，剩余血液均分為2份用于RNA及蛋白提取。

1.2.3RNA及蛋白提取 處理后的血標(biāo)本1份采用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后再采用TRizol試劑提取血標(biāo)本中的RNA；另1份同樣采用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后再采用RIPA裂解液提取血標(biāo)本中的蛋白。采用核酸蛋白分析儀和酶標(biāo)儀分別測定血標(biāo)本中RNA和蛋白的濃度。

1.2.4miR-141及HMGB1-mRNA表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒說明書對提取出的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)相應(yīng)基因序列設(shè)計引物，引物序列見表2，采用RT-PCR法檢測兩組患者血標(biāo)本中的miR-141及HMGB1 mRNA水平，具體反應(yīng)條件為95℃ 10 min，95℃ 15 s變性，60℃ 30 s退火，循環(huán)45次，反應(yīng)體系共10 μl，其中2×SYBR Green mixture 5.2 μl，cDNA 1.6 μl，引物3.2 μl。

1.2.5HMGB1、LC3及Beclin-1蛋白表達(dá)水平 用BCA試劑盒對提取出的蛋白定量后取20 μg蛋白，經(jīng)8%丙烯酰胺凝膠電泳，80 V電泳30 min，120 V電泳60 min，200 mA電轉(zhuǎn)(時間同分子量)后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h后加入一抗4℃孵育過夜，Actin為內(nèi)參，TBST洗滌5次，5 min/次，加入相應(yīng)二抗孵育1 h，TBST洗滌5次，5 min/次，經(jīng)ECL反應(yīng)后，顯影采集圖像，并使用ImageJ軟件掃描所得條帶得到灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1一般資料及生化指標(biāo) 本研究共納入60例患者及30例健康人，三組間性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而HLSAP組生化指標(biāo)PCT、 IL-6表達(dá)及入住ICU時間、急性生理與慢性健康狀況評分(Acute physiology and chronic health evaluationⅡ,APACHEⅡ)、序貫器官衰竭評分(Sequential organ failure assessment,SOFA)均高于HLMSAP組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般資料及生化指標(biāo)

Tab.1 Information and biochemical indicators of patients

NCHLMSAPHLSAPP valuen303030-M/F13/1716/1411/190.425Age(y)53.17±14.3149.40±15.8456.93±16.090.174PCT(mg/ml)-2.09±1.025.92±2.710.004IL-6(pg/ml)-166.21±68.93356.25±156.170.010Time for ICU(d)-3.77±1.5613.83±4.740.001APACHEⅡ-9.33±3.8913.33±5.330.008SOFA-3.47±1.235.03±2.070.018

表2 miR-141、HMGB1-mRNA及GAPDH引物序列

Tab.2 Primer sequence of miR-141，HMGB1 mRNA and GAPDH

GenePrimer sequence(5′→3′)Length(bp)miR-141Forward:CCCTGGGTCCATCTTCCAG89Reverse:GGGGCCATCTTTACCAGACAHMGB1Forward:GCTCAGAGAGGTGGAAGACCA149Reverse:GGTGCATTGGGATCCTTGAAGAPDHForward:TTGGTATCGTGGAAGGACTCA131Reverse:TGTCATATTTGGCAGGTTT

Note：GAPDH.glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

圖1 miR-141及 HMGB1 mRNA在疾病組及對照組中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-141 and HMGB1 mRNA in patients group and normal control groupNote: A.Expression of miR-141;B.expression of HMGB1 mRNA，*.P<0.05.

2.2RT-PCR結(jié)果 對照組、HLMSAP組及HLSAP組miR-141相對定量表達(dá)水平分別為1.75±0.23、1.15±0.27及0.54±0.08，疾病組表達(dá)均低于對照組，且HLSAP組表達(dá)最低(均P<0.05)， 而HMGB1

圖2 Western blot檢測HMGB1、LC3及Beclin-1蛋白在疾病組及對照組的表達(dá)Fig.2 Expressions of HMGB1，LC3 and Beclin-1 proteins in patient group and normal control group were detected by Western blotNote: A,B and C are expressions of HMGB1，LC3 and Beclin-1.*.P<0.05.

mRNA在對照組、HLMSAP組及HLSAP組中相對定量表達(dá)水平分別為0.72±0.29、1.54±0.37及3.12±0.46，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.3Western blot檢測 HMGB1蛋白在對照組、HLMSAP組及HLSAP組中相對定量表達(dá)水平分別為0.54±0.11、1.25±0.23和1.72±0.33；LC3蛋白在對照組、HLMSAP組及HLSAP組中相對定量表達(dá)水平分別為0.68±0.05、1.41±0.17及1.92±0.22；Beclin-1蛋白在對照組、HLMSAP組及HLSAP組中相對定量表達(dá)水平分別為0.49±0.14、1.27±0.29及1.94±0.43，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

3 討論

高脂血癥所致AP相對其他病因的AP病情更加嚴(yán)重，且并發(fā)癥發(fā)生率更高。近年來，多種研究發(fā)現(xiàn)HLAP的發(fā)病機(jī)制可能涉及炎性反應(yīng)、微循環(huán)障礙、氧化應(yīng)激、鈣超載、基因多態(tài)性、代謝異常等方面。而通過對其發(fā)病機(jī)制的深入研究，自噬在HLAP早期胰腺腺泡細(xì)胞損傷中的機(jī)制正受到越來越廣泛的關(guān)注[10]。

自噬是一種程序性生存方式，它是在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，將包裹在細(xì)胞質(zhì)中膜內(nèi)的自噬泡降解的過程，它對維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞代謝平衡具有重要作用[11]。生理性自噬并不能觸發(fā)HLAP的病理性過程，但HLAP自噬空泡的數(shù)量和體積都顯著增大，且彼此間還能互相融合。這表明此時的自噬乃為一種功能障礙的缺陷性自噬，是自噬過度、異常激活或自噬紊亂的結(jié)果[12]。結(jié)合本研究顯示，自噬標(biāo)志蛋白LC3及Beclin-1在患者血液中表達(dá)均上升，HLSAP組表達(dá)高于HLMSAP組，提示在患者體內(nèi)自噬水平增加，且在HLSAP患者體內(nèi)自噬程度更高，而通過兩組患者生化指標(biāo)及入ICU時APACHEⅡ評分及SOFA評分的比較，我們可以看出HLSAP組患者病情明顯較HLMSAP組更重，可見病情更嚴(yán)重的患者體內(nèi)自噬水平更高。

Beclin-1是首個被確認(rèn)的自噬基因，它位于人類染色體17q21上，長度約150 kb。它與酵母自噬基因Atg6同源，特異性地調(diào)節(jié)哺乳動物的自噬功能，從而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展和炎癥發(fā)揮重要作用[13]。LC3作為酵母Atg8(Aut7/Apg8)基因在哺乳動物細(xì)胞中的同源物，主要位于自噬泡和自噬泡膜的表面，參與自噬體的形成。LC3有Ⅰ型、Ⅱ型兩種，當(dāng)自噬發(fā)生在細(xì)胞時，新的LC3被合成，并由Atg4加工成LC3Ⅰ，泛素樣反應(yīng)酶再將其加工修飾，使其和膜表面磷脂酰乙醇胺耦合生成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ的量或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和自噬體的數(shù)量呈正比，因此LC3Ⅱ的量或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比在一定程度上反映了細(xì)胞自噬活性[14]。而通過我們對HLMSAP及HLSAP患者血樣本進(jìn)行檢測分析所得到的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在病情較重的HLSAP患者體內(nèi)Beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值均增高，可反映出在HLSAP患者體內(nèi)自噬水平高于病情較輕的HLMSAP患者。

HMGB1是一種能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的保守核蛋白，它可對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步影響細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組、DNA修復(fù)和基因組穩(wěn)定性。HMGB1除了核功能外，還可以作為細(xì)胞外信號分子調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)、自噬和癌癥[15]。研究表明，胞質(zhì)HMGB1是一種新型的Beclin-1結(jié)合蛋白，能使Beclin-1從其抑制伴侶凋亡抑制因子Beclin-2中分離，通過促進(jìn)Beclin-1和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶結(jié)合，激活自噬[16]。MicroRNA是一種單鏈非編碼RNA，通過分裂或翻譯抑制控制大多數(shù)基因的表達(dá)。有證據(jù)表明，改變MicroRNA的表達(dá)后，可能導(dǎo)致參與炎癥浸潤和多種疾病并發(fā)癥的關(guān)鍵生理功能的改變，包括HLAP[17,18]。且有研究證實，使用L-精氨酸造模成功的AP小鼠在使用miR-141模擬物處理后，胰腺組織中自噬標(biāo)志蛋白LC3表達(dá)下降，自噬體的形成明顯減少，并發(fā)現(xiàn)miR-141在HMGB1 mRNA的啟動子上通過與結(jié)合位點結(jié)合從而抑制HMGB1的表達(dá)，進(jìn)而通過抑制HMGB1/Beclin-1通路阻斷自噬體形成過程而下調(diào)自噬水平，拮抗miR-141后自噬程度增加，并加重了AP小鼠的病情進(jìn)展[8]。

而在HLAP患者體內(nèi)是否也有上述指標(biāo)的改變目前尚未得到驗證，我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HLAP患者體內(nèi)miR-141表達(dá)下降，且病情更加嚴(yán)重的HLSAP組下降更為明顯，其靶向蛋白HMGB1及其結(jié)合蛋白Beclin-1也在HLSAP組中上升程度更高；同時我們測得在HLAP患者體內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白上升，且在HLSAP組中上升更加明顯，提示自噬水平在HLAP患者體內(nèi)升高。故綜上所述，我們驗證了miR-141在HLAP患者體內(nèi)的表達(dá)下降，且隨著其下降，疾病嚴(yán)重程度也隨之增加，而且我們推測miR-141影響疾病發(fā)生發(fā)展的過程可能為miR-141與HMGB1的mRNA上結(jié)合位點結(jié)合從而靶向調(diào)控HMGB1的水平，進(jìn)而通過HMGB1/Beclin-1通路介導(dǎo)出現(xiàn)過度、異常自噬，導(dǎo)致了HLAP的發(fā)生發(fā)展，而miR-141也可能為HLAP基因治療的一個潛在靶點。