吳曉燕 厲 星

(浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院下沙院區(qū)藥學部，杭州310018)

膿毒癥是機體對感染的反應失調(diào)而引起的危及生命的器官功能障礙，常并發(fā)于感染、休克、大手術、燒/創(chuàng)傷、缺血-再灌注損傷等臨床極危重患者[1]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的重要成分，也是細菌分泌的內(nèi)毒素[2]。在膿毒血癥中，LPS起著重要的作用，它可激活多條信號通路，引起細胞功能紊亂，從而導致細胞壞死、凋亡[1,2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體[Nucleo-tide binding oligomerization domain(NOD)-like rece-ptors，NLR]是一類重要的細胞內(nèi)模式識別受體[3]。它可感受細胞內(nèi)感染性及非感染性信號的刺激，部分NLR被激活后可形成巨大的蛋白復合體即炎性小體(Inflammasome)[3]。炎性小體是一種多蛋白復合體，主要分為4種，即NLRP1、NLRP3、NLRP4和AIM2[3]。近年來國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體形成后進一步活化MAPK炎癥信號通路，進而激活NF-κB，產(chǎn)生TNF-α、IL-6和IL-1β等細胞因子[4,5]。木香烴內(nèi)酯(Costunolide，Cos)是一種倍半萜類化合物，主要來源于中藥木香等。近年研究報道Cos具有顯著的抗炎、保肝活性和清除活性氧自由基的作用[6-8]，但對于Cos抑制NLRP3炎性小體的激活來緩解炎癥反應的研究鮮少。本研究以小鼠腹腔巨噬細胞為對象，研究Cos對LPS誘導細胞炎性小體激活及細胞炎癥的調(diào)節(jié)作用，進一步探討Cos抑制炎癥的分子機制，為臨床運用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1材料

1.1.1細胞 原代小鼠腹腔巨噬細胞，提取自C57BL/6小鼠腹腔。C57BL/6小鼠(雄性，體重18～22 g)購自上海斯萊克動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005。

1.1.2藥物與試劑 木香烴內(nèi)酯、MCC950購自美國selleck公司； 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、辣根過氧化物酶標記山羊抗體兔IgG/鼠IgG、p-ERk鼠單克隆抗體、ERK鼠多克隆抗體、p-IκB兔單克隆抗體、IkB鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz；NLRP3兔單克隆抗體、抗GAPDH兔單克隆抗體購自德國CST公司； FITC-conjugated二抗購自英國Abcam公司；RNA提取試劑購自大連TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；TNF-α/IL-6 ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.1.3主要儀器 蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜與曝光系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；SpectraMaxM2型酶標儀購自Molecular Devices 生物科技公司；倒置及正置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組處理 原代巨噬細胞培養(yǎng)：先在小鼠腹膜腔注射肉湯(肉湯配方：牛肉膏0.15 g、蛋白胨0.5 g、KCl 0.25 g，可溶性淀粉3 g，50 ml ddH2O煮沸溶解過濾)，2 d后脫頸處死小鼠，RPMI1640培養(yǎng)基腹腔沖洗，收集腹腔灌洗液，500 g離心5 min，更換RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗分為空白對照組(Veh)：等量DMSO處理細胞，模型組(單用LPS)：等量DMSO處理1 h后，用1 mg/L LPS 處理；不同濃度(5、10和20 μmol/L)Cos+LPS組：不同濃度Cos預處理細胞1 h后，用1 mg/L LPS 處理，6 h和24 h提取細胞總RNA和培養(yǎng)液上清。為明確Cos對細胞炎癥反應的緩解機制，增加MCC950組：MCC950 10 μmol/L預處理細胞1 h后，1 mg/L LPS 處理，4 h和6 h提取細胞總蛋白。

1.2.2RNA的提取與實時熒光定量PCR檢測細胞炎癥因子 細胞研磨后，加入1 ml提取試劑，收集到1.5 ml EP管，加入200 ml氯仿，渦旋15 s，室溫靜置5 min，離心(12 000 g,15 min,4℃)，吸出分離出的無色上層到另一EP管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10 min，離心(12 000 g,10 min，4℃)，去掉上清，加入1 ml 75%乙醇，離心(7 500 g,5 min,4℃)。去掉上清，吸出明顯液體，室溫干燥10 min，加入DEPC水溶解RNA，測量RNA的純度(OD260/OD280)及濃度。 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用隨機六聚體引物(Random Hexamer Primer)和轉(zhuǎn)錄酶(SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。獲得的cDNA通過實時定量PCR(quantitative real-time PCR)分析檢測炎癥因子(IL-6/TNF-α)mRNA的表達水平，引物序列見表1[9]。

1.2.3Western blot檢測細胞ERK、IκB和NLRP3的表達與激活 細胞裂解后，測蛋白濃度并配平每個蛋白的上樣量。按20 μl/60 μg/泳道上樣總蛋白。等量的蛋白通過SDS膠進行分級分離，然后濕法轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，分子量小的用0.2 μm孔徑的膜，分子量大的用0.45 μm孔徑的膜。90 min后用5%脫脂牛奶進行封閉，待封閉好后加入一抗(NLRP3兔單克隆抗體、p-ERk鼠單克隆抗體、ERK鼠多克隆抗體、p-IκB兔單克隆抗體、IκB鼠單克隆抗體和抗GAPDH兔單克隆抗體)，置室溫搖床2 h之后移至4℃搖床過夜。 次日加入辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗，二抗孵育1 h后用TBST洗滌3次。加 ECL(A液與B液1∶1)，避光孵育2 min，曝光儀成像。

表1 實時定量PCR的引物序列

Tab.1 Primer sequence of real-time quantitative PCR

GeneSpeciesPrimers(FW)Primers(RW)TNF-αMouseTGATCCGCGACGTGGAAACCGCCTGGAGTTCTGGAAIL-6MouseGAGGATACCACTCCCAACAGACCAAGTGCATCATCGTTGTTCATACAβ-actinMouseCCGTGAAAAGATGACCCAGATACGACCAGAGGCATACAG

1.2.4ELISA測細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的含量 炎癥因子(TNF-α/IL-6)水平檢測：提取并培養(yǎng)原代巨噬細胞，按照3×106個/孔接種在6孔板中，培養(yǎng)3 d后給予藥物，繼續(xù)孵育1 h，加入1 mg/L LPS，24 h后收集細胞上清液，并檢測細胞蛋白濃度。96孔ELISA板包被炎癥因子(TNF-α/IL-6)的捕獲抗體，4℃過夜。次日，運用PBST(0.1%Tween-20的PBS)洗滌3次，吸水紙拍干剩余液體，用BSA封閉含有抗體的ELISA板1 h，加入細胞培養(yǎng)上清液，室溫孵育2 h。2 h后運用PBST洗滌3次，加入炎癥因子(TNF-α/IL-6)的檢測抗體,室溫孵育1 h。1 h后運用PBST洗滌3次，加入Strapavaidin-HRP，室溫孵育30 min。隨后加入HRP顯色底物(TMB)室溫避光孵育15 min。15 min后加入終止緩沖液(4%H2SO4)，運用酶標檢測儀，檢測450 nm的吸光度。

1.2.5免疫熒光染色法觀察細胞內(nèi)NLRP3的表達 細胞處理后，棄培養(yǎng)上清液，冷PBS洗滌1次，加入4%多聚甲醛，冰上固定10 min,加入冷甲醇，冰上通透2 min,冷PBS洗滌3次，加入1%BSA的PBS，室溫封閉1 h。棄封閉液，加入NLRP3兔單克隆抗體，按照1∶200比例用1%BSA的PBS稀釋，4℃搖床過夜，棄一抗，PBS洗滌3次，加入二抗(FITC標記的二抗)，按照1∶200比例用1%BSA的PBS稀釋，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，加入抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1Cos對LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子mRNA表達的影響 qPCR結(jié)果顯示，巨噬細胞經(jīng)1 mg/L LPS誘導6 h后，IL-6和TNF-α mRNA的表達量大幅上調(diào)，而在加入LPS前1 h用Cos處理細胞，則能顯著抑制IL-6和TNF-α mRNA表達量的升高，并呈劑量依賴性(圖1)。

2.2Cos對LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子分泌的影響 結(jié)果如圖2所示，與空白對照組比較，巨噬細胞經(jīng)1 mg/L LPS誘導24 h后，LPS組細胞培養(yǎng)液上清中IL-6和TNF-α含量顯著升高(P<0.001)。與LPS組比較，Cos組細胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α含量顯著降低，并呈劑量依賴關系(圖2)。

2.3Cos緩解LPS誘導的巨噬細胞炎性小體 如圖3A所示，與對照組相比，LPS處理后，NLRP3的表達明顯增強。在加入LPS前1 h用Cos處理細胞，LPS誘導NLRP3蛋白的表達劑量依賴性降低，其抑制效果與NLRP3抑制劑MCC950相當(圖3A)。類似的結(jié)果可在細胞免疫熒光染色觀察到(圖3B)。

為明確木香烴內(nèi)酯是通過抑制NLRP3發(fā)揮其抗炎作用，進一步實驗利用NLRP3的siRNA(siNLRP3)處理原代巨噬細胞12 h后，再用木香烴內(nèi)酯或MCC950處理，最后1 mg/L LPS刺激巨噬細胞24 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siNLRP3可有效降低巨噬細胞NLRP3的蛋白表達(圖4A)，并且沉默NLRP3可抑制LPS誘導巨噬細胞炎癥因子IL-6(圖4B)和TNF-α(圖4C)的分泌(P<0.01)， 而木香烴內(nèi)酯或MCC950 不影響siNLRP3對巨噬細胞炎癥因子IL-6和TNF-α分泌的作用，表明木香烴內(nèi)酯可能通過抑制NLRP3激活降低LPS誘導巨噬細胞的炎癥反應。

圖1 Cos對LPS刺激下小鼠原代巨噬細胞炎癥因子IL-6和TNF-α mRNA表達的影響Fig.1 Effect of Cos on expression of IL-6 and TNF-α mRNA in primary macrophages induced by LPS in vitroNote: Compared with the control group,###.P<0.001;compared with the LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖2 Cos對LPS刺激下小鼠原代巨噬細胞炎癥因子IL-6和TNF-α分泌的影響Fig.2 Effect of Cos on secretion of inflammatory factors IL-6 and TNF-α by LPS-stimulated macrophageNote: Compared with control group,###.P<0.001;compared with the LPS group,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 Cos對LPS刺激下小鼠原代巨噬細胞NLRP3的表達與激活的影響Fig.3 Effect of Cos on expression and activation of NLRP3 in LPS-stimulated macrophagesNote: Compared with control group,###.P<0.001;Compared with the LPS group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖4 Cos通過抑制NLRP3緩解LPS誘導小鼠原代巨噬細胞的炎癥反應Fig.4 Cos alleviates inflammatory response of primary macrophages induced by LPS by inhibiting NLRP3Note: Compared with control group,###.P<0.001;compared with the LPS group,***.P<0.001.

圖5 Cos對LPS刺激下小鼠原代巨噬細胞中ERK(A)及IκB(B)的表達與激活的影響Fig.5 Effect of Cos on expression and activation of ERK(A) and IκB(B) in LPS-stimulated macrophagesNote: Compared with control group,###.P<0.001;Compared with the LPS group,*.P<0.05，**.P<0.01.

2.4Cos緩解LPS誘導的ERK、IκB在巨噬細胞中的激活 如圖5A、B所示，與對照組相比，LPS處理后，ERK與IκB的磷酸化明顯增強。Cos預處理巨噬細胞1 h 后，ERK與IκB的磷酸化被顯著抑制，呈劑量依賴關系；其對ERK與IκB的磷酸化的抑制效果與NLRP3抑制劑MCC950相當。

3 討論

膿毒癥(Sepsis)是嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克、外科大手術后常見的并發(fā)癥，進一步發(fā)展可導致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(MODS)等，已成為臨床危重患者的重要死亡原因之一[1]。目前應用于臨床治療膿毒癥的藥物鮮少，從膿毒癥發(fā)病機制中尋找治療靶點有著重要意義。NLRP3炎性小體目前是最具表征性的炎性小體之一，主要由識別炎癥的模式識別受體蛋白NLR、銜接蛋白和效應蛋白三部分組成[3]。NLRP3炎性體的激活導致了促炎細胞因子IL-6和TNF-α等表達與分泌[10]，在許多炎癥反應性疾病中扮演著重要的角色[11]。研究報道，IL-6和TNF-α是重要的促炎癥細胞因子，其分泌與NLRP3炎性小體激活相關，而抑制NLRP3炎性小體激活可有效降低其分泌[12]。亦有國外研究指出，抑制NLRP3炎性小體激活可降低NF-κB的激活，從而緩解炎癥反應與膿毒癥[4]。

木香烴內(nèi)酯廣泛存在于木香中，具有廣泛的藥理作用。有研究顯示Cos明顯減輕LPS誘導的肝臟病理變化，同時抑制肝組織中NF-κB活化及白介素(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達[7]，具有抑制多種神經(jīng)炎癥介質(zhì)表達的能力[6]。除此之外，Cos誘導的HO-1表達和Nrf2核積累，能抑制LPS誘導的TNF-α和IL-6的產(chǎn)生[8]。TNF-α和IL-6是眾多炎癥因子中學者們關注較多的炎癥介質(zhì)，主要與內(nèi)毒素造成的疾病有關。本研究發(fā)現(xiàn)通過LPS誘導小鼠巨噬細胞6 h后，炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表達水平顯著升高，而在Cos處理組中明顯降低。此外，通過LPS誘導小鼠巨噬細胞24 h后，炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌顯著升高，Cos處理組中明顯降低。結(jié)果說明，Cos對LPS誘導的巨噬細胞TNF-α和IL-6炎癥因子的分泌具有明顯的抑制作用，進一步說明Cos可能通過抑制炎癥因子的過表達參與機體抗炎癥反應的過程。

NLRP3炎性小體的激活與炎癥密切相關，有研究表明限制NLRP3炎性小體與MAPK/NF-κB的反饋激活可調(diào)控巨噬細胞的激活[5]。本實驗Western blot和細胞免疫熒光均發(fā)現(xiàn)LPS刺激小鼠巨噬細胞4 h后，NLRP3的蛋白水平顯著升高，而Cos處理組中NLRP3的蛋白水平明顯降低。實驗結(jié)果表明，Cos的抗炎活性可能是通過降低炎性小體的激活。為進一步驗證這一猜想，后續(xù)實驗采用siRNA NLRP3沉默巨噬細胞NLRP3表達，繼而用木香烴內(nèi)酯或MCC950處理細胞后再用LPS刺激細胞24 h，結(jié)果顯示木香烴內(nèi)酯或MCC950在NLRP3缺失的情況下無法發(fā)揮其抗炎作用，表明木香烴內(nèi)酯對LPS誘導的炎癥反應的緩解作用源自其對NLRP3的抑制活性。另外，有研究指出NLRP3炎性小體的激活可引起AMPK、Akt 及NF-κB信號通路的激活，增強血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS誘導小鼠巨噬細胞NLRP3炎性小體與ERK/NF-κB信號通路的激活，Cos預處理抑制了NLRP3炎性小體和ERK/NF-κB信號通路的激活。與已報道的研究結(jié)果相似，我們的研究結(jié)果也顯示NLRP3炎性小體可能通過MAPK/NF-κB信號通路參與到炎癥反應。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)木香烴內(nèi)酯能通過有效抑制LPS誘導的巨噬細胞炎性小體和NF-κB信號通路的激活來緩解炎癥反應，這可能是一個治療膿毒血癥的有效單體。