劉啟方 黃 晶 田龍海 安亞平 岳 峰

(貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽550002)

心肌缺血再灌注損傷是心臟缺血后伴隨血流再通而發(fā)生的病理生理過程，研究證明缺血后的心肌重新恢復(fù)血流灌注會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化[1]。心肌纖維化(Myocardial fibrosis，MF)是心肌組織病理性的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)積聚，導(dǎo)致心肌僵硬，舒張或收縮功能下降，最終引起心力衰竭。它在多種心血管疾病中普遍存在，是心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)[2，3]。miRNA-25作為在心臟中相對(duì)高表達(dá)的miRNA，參與心肌纖維化、心臟重構(gòu)、心力衰竭等許多病理生理的調(diào)控[4，5]。H9C2心肌細(xì)胞是來源于胚胎期心臟組織的細(xì)胞,與原代心肌細(xì)胞相比，H9C2細(xì)胞具有增殖分裂的能力，其電生理、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路及許多生物學(xué)活性與原代心肌細(xì)胞相似。本研究通過構(gòu)建高表達(dá)miR-25 H9C2穩(wěn)定細(xì)胞系，探討miR-25對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌纖維化的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 H9C2心肌細(xì)胞株來自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及HMGB1抗體購(gòu)自Gibco公司，TIMP2、MMP2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin、TGF-β、P-smad3及P-ERK1/2抗體購(gòu)自Abcam公司；RIPA裂解液(強(qiáng))、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物有限公司。熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；穩(wěn)壓電泳儀(美國(guó)HealForce公司)；紫外可見分光光度計(jì)(上海spectrum公司)。

1.2方法

1.2.1H9C2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 在超凈臺(tái)中將保存的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入5 ml配制好的DMEM培養(yǎng)基的離心管中。混勻后離心，去上清液，加入5 ml新的DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。選取處于生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)象，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105ml-1，取6孔培養(yǎng)板,每孔分別接種2 ml細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行慢病毒感染。實(shí)驗(yàn)分為5組：Control組為空白對(duì)照組未進(jìn)行轉(zhuǎn)染；陰性對(duì)照組Lv-control組和Lv-anti-control組分別轉(zhuǎn)染Lv-control-miRNA mimic及Lv-control-miRNA inhibitor；實(shí)驗(yàn)組Lv-miR-25組和Lv-anti-miR-25組分別轉(zhuǎn)染Lv-miR-25 mimic及Lv-miR-25 inhibitor。向轉(zhuǎn)染組細(xì)胞懸液中分別加入polybrene溶液(終濃度5 μg/ml)以及慢病毒載體,用吸管吹打均勻后接種于6孔板，6 h后加入新鮮培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞完全貼壁后，更換新鮮DMEM培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞匯合度約80%以上，加入含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選獲得不穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。擴(kuò)大培養(yǎng)各感染組陽性細(xì)胞。

1.2.2Real-time PCR檢測(cè)miR-25表達(dá) 采用Real-time PCR檢測(cè)miR-25高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功，miR-25 的逆轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGA-CTCAGACC-3′。PCR的上游引物為5′-ATCCAG-TGCGTGTCGTG-3′，下游引物為5′-TGCTCATTGCACTTGTCTC-3′。PCR的擴(kuò)增條件為 95℃ 預(yù)變性 1 min、95℃ 變性 10 s、60℃ 退火、延伸 40 s，重復(fù) 40 個(gè)循環(huán)。計(jì)算miR-25的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3構(gòu)建缺氧/復(fù)氧損傷H9C2細(xì)胞模型 新鮮的DMEM培養(yǎng)液，用CO2和氮?dú)獾幕旌蠚怏w充分飽和4 h后，加入小牛血清制成缺氧培養(yǎng)液。將轉(zhuǎn)染后擴(kuò)大培養(yǎng)的各組細(xì)胞，加入胰酶消化，離心，去上清液，接種于缺氧培養(yǎng)液。在37℃缺氧培養(yǎng)箱(1%O2、5%CO2、94%N2)培養(yǎng)的各組H9C2細(xì)胞24 h構(gòu)建缺氧模型；缺氧模型構(gòu)建后，取出培養(yǎng)瓶，加入胰酶消化，離心。去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液放置37℃常氧培養(yǎng)箱(95%空氣和5%CO2)培養(yǎng)心肌細(xì)胞1 h,構(gòu)建復(fù)氧模型。

1.2.4Real-time PCR檢測(cè)干預(yù)miR-25的表達(dá)對(duì)HMGB1表達(dá)的影響 Real-time PCR檢測(cè)Control組、Lv-control組、Lv-anti-control組、Lv-control-miRNA mimic組、Lv-control-miRNA inhibitor組的HMGB1表達(dá)。按照Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證總RNA的完整性。再根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，HMBG1上游引物5′-CCGGATGCTTCTGTCAACTT-3′,下游引物5′-TTGATTTTTGGGCGGTACTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度是248 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95%預(yù)變性5 min，95%變性10 s、60%退火20 s，延伸20 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。計(jì)算各組HMGB1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5Western blot檢測(cè)Fibronectin、MMP2、TIMP2、CollagenⅠ及CollagenⅢ的蛋白水平 取待測(cè)組織于EP管中，加入蛋白裂解液，離心沉淀提取全蛋白。調(diào)整蛋白量，Brad-ford 法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，半干法轉(zhuǎn)移凝膠至PVDF膜，5%BSA慢搖4 h封閉膜，洗膜后加入Ⅰ抗4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入Ⅱ抗孵育2 h,TBST洗滌，慢搖2 h后，進(jìn)行ECL顯色。

1.2.6轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA抑制HMGB1的表達(dá)，Western blot檢測(cè)HMGB1、MMP2、TIMP2、CollagenⅠ及CollagenⅢ的蛋白水平 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞接種于6孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000試劑盒說明將control-shRNA與HMGB1-shRNA分別轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分control-shRNA組、HMGB1-shRNA組。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。轉(zhuǎn)染成功后行缺氧/復(fù)氧損傷處理后，檢測(cè)HMGB1、MMP2、TIMP2、CollagenⅠ及CollagenⅢ的蛋白表達(dá)。

1.2.7雙熒光素報(bào)告基因檢測(cè)miR-25與HMGB1的靶向作用 從NCBI中下載人HMGB1-3′UTR基因序列，NCBI Reference Sequence為NM_002128.4，采用Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。通過瓊脂糖凝膠電泳將擴(kuò)增條帶分離，然后將純化的擴(kuò)增片段收回，克隆進(jìn)入psiCHECKTM-2 載體，構(gòu)建HMGB1-3′UTR-psiCHECKTM-2與Mut-HMGB1-3′UTR-psiCHE-CKTM-2載體。將miRNA-25與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天取24孔培養(yǎng)板，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞，用含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，將脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒及miRNA-25溶液混合，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育5 h后，換新鮮的含血清DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后2 d，制成細(xì)胞裂解液。加入預(yù)先配好的用于Lucifersae檢測(cè)的工作液，采用生物發(fā)光檢測(cè)儀讀取背景值。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR法檢測(cè)miR-25 mimic/inhibitor在H9C2細(xì)胞中的表達(dá)效率 在H9C2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Lv-control、Lv-miR-25、Lv-anti-control、Lv-anti-miR-25構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，使用real-time PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組H9C2心肌細(xì)胞miR-25的表達(dá)。結(jié)果顯示相比于Lv-control對(duì)照組，Lv-miR-25組 H9C2心肌細(xì)胞中miR-25的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Lv-anti-miR-25組H9C2心肌細(xì)胞中miR-25的表達(dá)水平明顯下降，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1。

圖1 miR-25的表達(dá)Fig.1 Expression level of miR-25Note: *.P<0.01.

2.2Real-time PCR檢測(cè)干預(yù)miR-25表達(dá)的缺氧/復(fù)氧損傷H9C2細(xì)胞的HMGB1表達(dá) 在H9C2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Lv-control、Lv-miR-25、Lv-anti-control、Lv-anti-miR-25構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，行缺氧24 h/復(fù)氧 1 h處理后，收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總RNA，Real-time PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞HMGB1的表達(dá)。結(jié)果顯示相比于Lv-control對(duì)照組，Lv-miR-25組 缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而Lv-anti-miR-25組H9C2心肌細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)水平明顯升高，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2。

2.3Western blot檢測(cè)H9C2細(xì)胞HMGB1及纖維化因子的表達(dá)水平 構(gòu)建高表達(dá)miR-25 H9C2穩(wěn)定細(xì)胞系，行缺氧24 h/復(fù)氧 1 h處理后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用Western blot的方法檢測(cè)HMGB1、Fibronectin、CollagenⅢ、CollagenⅠ、MMP2、TIMP2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與Lv-control組相比，Lv-miR-25組HMGB1的蛋白表達(dá)下降，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，高表達(dá)miR-25降低HMGB1的表達(dá)。同樣與Lv-control組相比，Lv-miR-25組的Fibronectin、CollagenⅢ、CollagenⅠ、MMP2、TIMP2蛋白表達(dá)顯著下降，而Lv-anti-miR-25組的蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

2.4Western blot檢測(cè)HMGB1-shRNA在H9C2細(xì)胞中表達(dá)效率 構(gòu)建了干擾HMGB1慢病毒載體(Lv-HMGB1-shRNA)、陰性對(duì)照慢病毒載體(Lv-Control-shRNA),并將其轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞，培養(yǎng)后篩選出穩(wěn)定細(xì)胞系。通過Real-time PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組H9C2心肌細(xì)胞HMGB1的表達(dá),結(jié)果顯示相比于陰性對(duì)照組，HMGB1-shRHA組HMGB1 mRNA表達(dá)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖4 。

圖2 HMGB1的表達(dá)Fig.2 Expression level of HMGB1Note: *.P<0.01.

圖3 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of protein determined by Western blotNote: *.P<0.05.

圖4 Western blot檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of HMGB1 protein determined by Western blotNote: *.P<0.01.

圖5 Western blot檢測(cè)纖維相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of fibrosis-related protein determined by Western blotNote: *.P<0.05.

2.5Western blot檢測(cè)沉默HMGB1的H9C2細(xì)胞纖維化因子的表達(dá)水平 對(duì)干擾HMGB1表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系行缺氧/復(fù)氧損傷處理后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用Western blot的方法檢測(cè)TIMP2、MMP2、CollagenⅢ、CollagenⅠ蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，Lv-HMGB1-shRNA組纖維蛋白表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

2.6miR-25靶向調(diào)控HMGB1表達(dá) 用micro-RNA.org-Targets and Expression進(jìn)行HMGB1的miRNA

圖6 miR-25與HMGB1的 非翻譯區(qū)序列互補(bǔ)(3′-UTR)Fig.6 Sequence complementarity of miR-25 and untransl-ated region of HMGB1 gene(3′-UTR)

圖7 雙熒光素報(bào)告基因檢測(cè)Fig.7 Dual-luciferase reporter gene assayNote: *.P<0.05.

預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-25與HMGB1的非翻譯區(qū)序列互補(bǔ)，見圖6。通過分別轉(zhuǎn)染 miR-25 mimic、miR-25 inhibitor、NC-miRNA 或 NC-miRNA inhibitor和HMGB1-3′UTR-psiCHECKTM-2(野生型)與Mut-HMGB1-3′UTR-psiCHECKTM-2(突變型)熒光素酶報(bào)告基因載體進(jìn)入H9C2細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性的變化。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-25mimic后，相對(duì)于空白對(duì)照組，攜帶有HMGB1野生型報(bào)告基因載體組的熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度下降了約50%，而攜帶有HMGB1突變型報(bào)告基因載體組在轉(zhuǎn)染miR-25mimic后熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度沒有明顯變化，表明miR-25靶向調(diào)控 HMGB1基因，見圖7。

3 討論

ECM主要由膠原蛋白Ⅰ型和膠原蛋白Ⅲ型組成，占ECM的80%～90%左右，其他為黏連蛋白、彈性蛋白及其他膠原蛋白等[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)特異性降解ECM成分的Zn2+依賴的酶家族，TIMPs是MMPs的特異性抑制因子，其抑制MMPs對(duì)ECM的降解[7]。心肌細(xì)胞纖維化同樣與膠原蛋白Ⅰ型、膠原蛋白Ⅲ型、TIMPs及MMPs表達(dá)水平相關(guān)。MMPs家族中MMP2在心肌組織中表達(dá)水平較高，是心肌內(nèi)抗纖維化的重要成分[8]。在TIMPs家族中，TIMP2對(duì)MMPs的抑制作用最強(qiáng)。MMP2的天然抑制物TIMP2也存在于心肌組織中，并可通過與相應(yīng)的MMP2結(jié)合從而影響其活性，MMP2/TIMP2的平衡對(duì)維持心肌正常的膠原代謝具有重要意義[9，10]。因此本研究通過檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ型、膠原蛋白Ⅲ型、MMP2及TIMP2能反映心肌細(xì)胞纖維化的程度。

本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒構(gòu)建高表達(dá)miR-25的穩(wěn)定細(xì)胞系后，行缺氧/復(fù)氧處理，結(jié)果提示高表達(dá)miR-25的膠原蛋白Ⅰ型、膠原蛋白Ⅲ型、MMP2及TIMP2蛋白表達(dá)減少，心肌細(xì)胞纖維化減少。轉(zhuǎn)染miR-25 inhibitor的穩(wěn)定細(xì)胞系，得到相反的結(jié)果。miR-25對(duì)缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞具有降低纖維化的作用。Tang等[11]研究發(fā)現(xiàn)在TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)化過程中，miR-25表達(dá)下調(diào)，高表達(dá)miR-25能減少上皮細(xì)胞間質(zhì)化，降低纖維化進(jìn)程。本研究得到miR-25降低纖維化作用與Tang的研究結(jié)果一致。

HMGB1導(dǎo)致心肌纖維化途徑非常復(fù)雜，Su等[12]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1與TLR結(jié)合，經(jīng)與絲/蘇氨酸蛋白激酶相互作用，激活ERK途徑導(dǎo)致心肌膠原沉積。Wang等[13]在糖尿病心肌病的大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，抑制HMGB1的表達(dá)能夠降低膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的沉積，改善左心室功能障礙。本研究通過轉(zhuǎn)染shRNA-HMGB1沉默H9C2細(xì)胞HMGB1的表達(dá)，行缺氧/復(fù)氧處理，結(jié)果顯示下調(diào)HMGB1表達(dá)，導(dǎo)致膠原蛋白Ⅰ型、膠原蛋白Ⅲ型、MMP2及TIMP2的蛋白表達(dá)降低，纖維化減輕。由此可見，與既往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一樣，HMGB1有促進(jìn)纖維化作用。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-25與HMGB1均參與纖維化的進(jìn)程；MicroRNA.org-Targets and Expression進(jìn)行HMGB1的miRNA預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-25與HMGB1存在潛在的靶向作用，見圖6。實(shí)驗(yàn)通過干預(yù)miR-25的表達(dá)，檢測(cè)其變化對(duì)HMGB1表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者呈負(fù)向調(diào)控關(guān)系，高表達(dá)miR-25，HMGB1表達(dá)下調(diào)；低表達(dá)miR-25，HMGB1表達(dá)上調(diào)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)通過雙熒光素報(bào)告基因證實(shí)miR-25對(duì)HMGB1有靶向調(diào)控作用，據(jù)此推斷miR-25通過下調(diào)HMGB1表達(dá)發(fā)揮其降低心肌細(xì)胞纖維化的作用。本研究雖然證實(shí)miR-25經(jīng)HMGB1途徑調(diào)控心肌細(xì)胞纖維化進(jìn)程，但未能進(jìn)一步探討HMGB1導(dǎo)致心肌細(xì)胞纖維化的機(jī)制，以及miR-25是否也會(huì)經(jīng)由其他途徑調(diào)控心肌細(xì)胞纖維化的進(jìn)程，對(duì)此應(yīng)繼續(xù)深入研究。