趙志明，曹明雅，趙雙丹，周亮，朱序理，王躍

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，石家莊 050000)

隨著凍融技術(shù)及卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)的發(fā)展，大大提高了冷凍卵子的復(fù)蘇率及受精率，卵子冷凍技術(shù)已逐漸應(yīng)用于臨床。但凍融后的卵子存活率、受精率、胚胎著床率及臨床妊娠率仍有待提高[1]。哪些因素會影響卵子凍融后的發(fā)育潛能，卵子冷凍周期的臨床和實(shí)驗(yàn)室因素及解凍周期的實(shí)驗(yàn)室因素等對卵子的復(fù)蘇、受精及最終的妊娠結(jié)局有無影響作用，還存在爭議[2]。本研究回顧性分析卵子冷凍及解凍周期的臨床和實(shí)驗(yàn)室的各種指標(biāo)，探討臨床或?qū)嶒?yàn)室因素對玻璃化冷凍的成熟卵母細(xì)胞解凍移植后的妊娠結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對象

對2012年5月至2018年3月在我院生殖醫(yī)學(xué)科進(jìn)行卵子冷凍的周期進(jìn)行回顧性研究，共行90個卵子解凍周期，解凍后行ICSI受精，于受精后第3天行胚胎移植。根據(jù)是否妊娠分為妊娠組(44個周期)和未妊娠組(46個周期)。

卵子冷凍指征為：(1)取卵當(dāng)天獲得的卵子數(shù)目大于25 枚，且女方配子運(yùn)送障礙為其不孕原因，在預(yù)留足夠可用卵子后，冷凍保存部分成熟卵子；(2)取卵當(dāng)天，無法獲得足夠可授精的精子，但夫婦拒絕接受供精，冷凍保存其全部或部分成熟卵子。均在充分知情同意的基礎(chǔ)上，并經(jīng)倫理委員會討論通過。

二、研究方法

1.促排卵方案：采用常規(guī)控制卵巢刺激(COS)方案。根據(jù)患者年齡、基礎(chǔ)性激素水平、竇卵泡數(shù)目等卵巢儲備功能評價(jià)指標(biāo)選擇促排方案。COS過程中，通過超聲對卵泡大小進(jìn)行監(jiān)測，并以血清性激素水平作為參考，根據(jù)卵泡的直徑和血清性激素水平?jīng)Q定扳機(jī)時(shí)機(jī)，肌注HCG(珠海麗珠制藥)5 000～10 000 U，注射后34～36 h取卵。對女方年齡、不孕年限、COS使用方案、促性腺激素(Gn)用藥天數(shù)、Gn使用量(支數(shù))、HCG注射日(HCG日)血清雌二醇(E2)水平、獲卵數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.脫顆粒及卵子冷凍：預(yù)培養(yǎng)獲得的卵母細(xì)胞，使用透明質(zhì)酸酶80 U/ml對卵冠丘復(fù)合物脫顆粒，酶內(nèi)時(shí)間控制在30 s內(nèi)。脫顆粒后對卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟度的形態(tài)學(xué)評估。對成熟卵母細(xì)胞行封閉載體的玻璃化冷凍。室溫操作，冷凍保護(hù)劑及時(shí)間為(7.5% EG + 7.5% DMSO)平衡5 min，(15% EG + 15% DMSO + 0.2 mol/L蔗糖)至裝載時(shí)間在70 s內(nèi)。記錄成熟卵母細(xì)胞數(shù)、取卵至脫顆粒時(shí)間(T1)、脫顆粒至冷凍時(shí)間(T2)。卵子成熟度=成熟卵母細(xì)胞數(shù)/獲卵數(shù)×100%，取卵至冷凍時(shí)間(T3)= T1 + T2。

3.卵子解凍及ICSI受精：卵子解凍采用快速解凍方法，步驟為1.0 mol/L蔗糖37℃1 min，0.5 mol/L蔗糖室溫2 min，0.25 mol/L蔗糖3 min，10%人血清白蛋白取卵胚胎處理液(HSA G-MOPS，Vitrolife，瑞典)5 min，并逐漸升溫至37℃。解凍后評估卵子存活情況，經(jīng)培養(yǎng)后行ICSI，記錄存活卵子數(shù)目、解凍至ICSI時(shí)間(T4)。卵母細(xì)胞存活率=存活卵子數(shù)/解凍卵子數(shù)×100%。

4.胚胎移植和確定妊娠：ICSI后17 h觀察原核確定受精情況，第3天行胚胎評估，并選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，黃體支持采用黃體酮和(或)HCG。臨床妊娠為移植后14 d檢測血β-HCG為陽性，并在移植后4周行超聲檢查可見妊娠囊及原始心管搏動[3]。記錄正常受精卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、移植胚胎評分。正常受精率=正常受精卵數(shù)/ICSI卵數(shù)×100%；優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精的卵裂數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

所有研究對象解凍卵數(shù)766枚，解凍后存活卵數(shù)722枚，存活率94.26%；正常受精卵數(shù)578枚，正常受精率80.06%；優(yōu)胚數(shù)240枚，優(yōu)胚率41.52%。移植周期76個，復(fù)蘇移植率84.44%，移植胚胎數(shù)180枚，平均移植胚胎數(shù)2.37個，種植胚胎數(shù)54枚，種植率30.00%。妊娠周期44個，移植周期妊娠率57.89%，解凍周期妊娠率48.89%。

一、妊娠組和未妊娠組一般臨床資料比較

妊娠組女方年齡、不孕年限顯著低于未妊娠組，而妊娠組的HCG日E2水平、周期獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)顯著高于未妊娠組(P<0.05)；妊娠組和未妊娠組COS方案比較，妊娠組長方案較多，未妊娠組拮抗劑方案較多(P<0.05)；兩組間Gn用藥天數(shù)、Gn用藥量、成熟卵率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

組 別周期數(shù)年齡不孕年限用藥方案(個)長方案拮抗劑方案超長方案Gn用藥天數(shù)妊娠組 4428.10±4.90?4.50±3.50?40#4#09.70±2.10未妊娠組4632.40±5.906.80±3.601622810.40±2.90組 別周期數(shù)Gn用藥量(支)HCG日E2(pmol/L)獲卵數(shù)成熟卵數(shù)成熟卵率(%)妊娠組 4425.20±9.2014 598.60±5 181.67#21.70±14.80?19.50±13.10?90.74±10.50未妊娠組4631.40±12.009 392.81±6 868.4112.10±10.9011.00±10.8086.16±14.55

注：與未妊娠組比較，*P<0.05，#P<0.01

二、妊娠組和未妊娠組實(shí)驗(yàn)室資料比較

90個解凍卵子周期中，未移植周期14個，均為解凍1～4個卵子，其中8個周期無存活卵子，6個周期胚胎質(zhì)量差未移植。妊娠組脫顆粒至冷凍時(shí)間(T2)顯著短于未妊娠組(P<0.05)；卵子存活率、正常受精率、優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)胚率、移植胚胎的評分比較，妊娠組均顯著高于未妊娠組(P<0.05)；兩組間T1、T3、T4、解凍卵數(shù)、存活卵數(shù)、正常受精卵數(shù)、移植胚胎數(shù)目均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

三、T1、T2、T3、T4與實(shí)驗(yàn)室結(jié)局的相關(guān)性

T1、T2、T3和T4的時(shí)間范圍分別是1.13～7.20 h、0.67～5.00 h、3.83～8.47 h和0.50～5.33 h。T1與T2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.615，P=0.000)，與T3呈正相關(guān)(r=0.615，P=0.000)；T1與優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)胚率呈正相關(guān)，T2與卵子存活率、優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)，T3與卵子存活率呈負(fù)相關(guān)，T4與正常受精率呈負(fù)相關(guān)；卵子冷凍周期的成熟卵數(shù)與解凍卵數(shù)、存活卵數(shù)、正常受精卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)呈正相關(guān)，卵子解凍周期的優(yōu)胚率與存活率、正常受精率、優(yōu)胚數(shù)、移植胚胎評分呈正相關(guān)(表3)。

組 別周期數(shù)ICSI周期數(shù)移植周期數(shù)T1(h)T2(h)T3(h)T4(h)解凍卵數(shù)存活卵數(shù)妊娠組 4444442.90±1.852.82±1.25?5.72±1.503.76±1.339.30±5.809.10±5.50未妊娠組4638322.39±1.053.66±1.066.05±0.884.18±0.487.70±5.707.00±5.80組 別周期數(shù)存活率(%)正常受精卵數(shù)正常受精率(%)優(yōu)胚數(shù)優(yōu)胚率(%)移植胚胎數(shù)移植胚胎評分妊娠組 4498.54±2.86?8.00±4.8089.91±11.00?3.90±2.60#52.25±20.57?2.55±0.508.55±2.02#未妊娠組4684.24±30.385.40±4.3070.07±32.771.60±2.0031.06±34.962.13±0.815.50±2.19

注：與未妊娠組比較，*P<0.05，#P<0.01

表3 T1、T2、T3、T4與實(shí)驗(yàn)室結(jié)局的相關(guān)性(r值)

注：相關(guān)性分析，*P<0.05，#P<0.01

討 論

人類卵子冷凍技術(shù)成熟的標(biāo)志是其妊娠率和出生率接近于新鮮周期。但由于人類成熟卵母細(xì)胞的自身特點(diǎn)，如形態(tài)及結(jié)構(gòu)較胚胎復(fù)雜，體積大、含水多，質(zhì)膜通透性與穩(wěn)定性差，冷凍過程中由于體積與表面積比較大造成脫水困難易形成冰晶，復(fù)蘇過程中容易死亡，且紡錘體對冷凍過程的低溫非常敏感，影響了染色體的重新排列，從而使卵母細(xì)胞冷凍的應(yīng)用受限[4]。但是玻璃化冷凍技術(shù)的應(yīng)用，對卵母細(xì)胞冷凍的普及和發(fā)展起到關(guān)鍵作用。目前卵子冷凍主要應(yīng)用在以下幾個方面：(1)促排卵患者取卵日男方取精失敗或是不能獲得足夠用于授精的精子；(2)人類卵子庫的建立，為供卵項(xiàng)目提供便利；(3)腫瘤患者治療前卵子儲備；(4)常規(guī)卵巢刺激周期中，若獲卵多可將部分卵子冷凍保存；(5)避免因胚胎冷凍產(chǎn)生的倫理及立法限制；(6)延遲生育年齡；(7)為卵巢低反應(yīng)患者累積卵子[5-7]。

許多因素可能影響人類卵子的冷凍結(jié)局，如女性的年齡、不孕年限，不同的促排卵方案等。而卵母細(xì)胞的體積大小、質(zhì)量優(yōu)劣、所處的成熟階段以及其周圍包繞的顆粒細(xì)胞等都可能會對卵子冷凍后復(fù)蘇的存活、受精及隨后的卵裂造成極大的影響[8-10]。高質(zhì)量的卵子冷凍復(fù)蘇后存活率高，低質(zhì)量的卵子則復(fù)蘇存活率低。Rienzi等[11]對450對夫婦的486個周期進(jìn)行回顧性分析，共2 721枚卵子解凍，復(fù)蘇率84.7%；共ICSI 2 182枚卵子，受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為75.2%和48.1%；周期出生率和移植周期出生率為26.3%和29.4%。通過邏輯回歸分析發(fā)現(xiàn)，女方年齡、冷凍的卵子數(shù)目、移植天數(shù)會影響出生率。冷凍卵子數(shù)目≤8枚和8枚以上的出生率分別為22.6%和46.4%。年齡>38歲與≤38歲的女性出生率分別為12.6%和27.5%。而當(dāng)有>8枚卵子且進(jìn)行囊胚培養(yǎng)移植和卵裂期移植時(shí)，年齡>38歲與≤38歲的女性出生率為62.1%和40.7%。本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠組的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH水平都比非妊娠組低，而HCG日E2水平、獲卵數(shù)和成熟卵數(shù)比非妊娠組高。隨著獲卵數(shù)、雌激素水平和成熟卵子數(shù)目的增加，解凍卵子后可供選擇的機(jī)會也相應(yīng)增加，使得正常受精及優(yōu)質(zhì)胚胎增多。解凍卵子的正常受精率與凍存前卵子的成熟程度呈正相關(guān)，說明卵子成熟程度越高，卵子的質(zhì)量越好，解凍后卵子的正常受精率越高，優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)胚率也越高，最終移植時(shí)胚胎評分越高，胚胎質(zhì)量也越好，妊娠機(jī)會增大。

成熟卵母細(xì)胞要在最佳時(shí)間受精，因此對凍融卵母細(xì)胞的冷凍時(shí)間也應(yīng)嚴(yán)格限制。尋求最佳的冷凍時(shí)機(jī)及解凍后的ICSI時(shí)機(jī)可能是提高成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍質(zhì)量及改善輔助生殖結(jié)局的關(guān)鍵。有學(xué)者認(rèn)為成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的最佳冷凍時(shí)機(jī)是取卵后2 h內(nèi)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，取卵至脫顆粒時(shí)間(T1)與優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)胚率呈正相關(guān)，說明適當(dāng)延長取卵至脫顆粒時(shí)間可能增加MII卵子的比例，或是對胞質(zhì)的成熟有益；但也不能過度延長培養(yǎng)時(shí)間，否則會造成卵子老化。妊娠組脫顆粒至冷凍時(shí)間(T2)明顯短于非妊娠組，分別為2.82 h和3.66 h(P<0.05)；T2與取卵至冷凍時(shí)間(T3)正相關(guān)，與卵子復(fù)蘇存活率、優(yōu)胚數(shù)、優(yōu)胚率呈負(fù)相關(guān)，說明卵子存活率受時(shí)間的影響，脫顆粒后卵子可能發(fā)生老化，質(zhì)量下降，冷凍復(fù)蘇的效果不好，繼而影響優(yōu)胚率，可供選擇的好的胚胎減少。即使存活，形成的胚胎質(zhì)量也下降，因此適當(dāng)要縮短脫顆粒至冷凍時(shí)間。Porcu[13]也認(rèn)為，大卵齡的卵子凍存復(fù)活率、受精率減低，畸形受精和多倍性增加。此外，凍融卵母細(xì)胞的受精時(shí)間(不含冷凍保存的時(shí)間)為注射HCG后40 h，是行ICSI的最佳時(shí)間，可以獲得高質(zhì)量的卵母細(xì)胞[14]。研究已證實(shí)，玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞解凍后紡錘體的完全重建需要2 h。因此，解凍后的孵育時(shí)間應(yīng)為2 h[15]。目前一般控制解凍至ICSI時(shí)間在3 h內(nèi)，本研究妊娠組解凍至ICSI時(shí)間平均為3.76 h。取卵10 h后卵母細(xì)胞的發(fā)育能力下降。ICSI的代謝老化依賴于：HCG注射后取卵時(shí)間，冷凍前預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，解凍到受精時(shí)間。取卵后至冷凍前的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間在避免注射老齡卵母細(xì)胞上有著重要的作用。冷凍前過度延長培養(yǎng)時(shí)間，卵膜滲透率等特性會隨著時(shí)間改變，可能會影響卵母細(xì)胞冷凍后的能力，因此建議卵子必須在取卵后的8 h內(nèi)進(jìn)行冷凍保存[13]。

總之，卵子冷凍周期女方年齡及成熟卵數(shù)對卵子解凍周期的妊娠結(jié)局有重要影響作用。適當(dāng)延長取卵至脫顆粒時(shí)間、縮短脫顆粒至冷凍時(shí)間可能通過使卵胞質(zhì)進(jìn)一步成熟、降低脫顆粒后卵子老化，而提高卵子解凍存活率及發(fā)育潛能。