張 雅，滕 蔓，李會珍，朱志堅，劉豪麗,3，羅 俊,3，張改平,4

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室/農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室/河南省動物免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室，河南鄭州450002；3.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院/動物疫病與公共安全重點(diǎn)實驗室，河南洛陽471003；4.揚(yáng)州大學(xué)江蘇高校動物重要疫病與人獸共患防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009)

雞馬立克病(Marek's disease，MD)是由α-皰疹病毒成員馬立克病病毒(MD virus，MDV)感染引起雞的一種高度接觸性、傳染性淋巴細(xì)胞增生性疾病[1]，該病給世界養(yǎng)禽業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失。雖然現(xiàn)有的疫苗對MD 腫瘤的發(fā)生起到了很好的免疫保護(hù)作用，但隨著長期的疫苗免疫壓力及病毒自身進(jìn)化，已導(dǎo)致越來越多毒力增強(qiáng)的致病型病毒株的出現(xiàn)。另外，MDV 感染宿主可引起宿主免疫抑制及快速發(fā)作的T淋巴細(xì)胞腫瘤，其被認(rèn)為是研究病毒誘發(fā)腫瘤的良好生物模型[2]。因此，深入研究和揭示MDV 的感染及致病機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

MicroRNA (miRNA)是一類重要的非編碼小分子RNA，長度約22 nt～24 nt，其參與調(diào)控多種重要的生物過程，包括生長、發(fā)育、分化、凋亡、疾病及腫瘤發(fā)生等[3]。MDV 編碼的病毒miRNA 在基因組中形成3 個基因簇，分別命名為Meq、Mid 和LAT miRNA 基因簇[4]，已發(fā)現(xiàn)其中一些病毒miRNA 在MD 腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[5-8]。前期研究Mid 基因簇中的miRNA 與MDV 致病表型關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，缺失miR-M31-3p 前體miRNA 的病毒對感染雞的致瘤率明顯降低，預(yù)示miR-M31-3p 可能調(diào)控MD 的腫瘤發(fā)生[9]。為了揭示miR-M31-3p 的調(diào)控機(jī)制，本研究利用3'-Full Race 和雜交PCR 構(gòu)建了miR-M31-3p 的宿主候選靶基因cDNA 文庫，同時結(jié)合雙熒光素酶報告實驗、miRNA 過表達(dá)和qRT-PCR分析等方法篩選鑒定miR-M31-3p 的宿主靶基因，為后續(xù)揭示miR-M31-3p 調(diào)控MD 腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和質(zhì)粒 MDV GX0101 株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)崔治中教授惠贈。MDV miR-M31-3p 基因缺失株GXΔmiR-M31 以及HEK293T 細(xì)胞、pcDNA6.2-miR-neg、pcDNA6.2-miR-M31、pcDNA6.2-mut-miRM31 和psiCHECKTM-2 載體均由河南省農(nóng)科院動物免疫室制備并保存。原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)由7 日齡～8 日齡SPF 雞胚制備，用于miRNA 過表達(dá)和病毒感染試驗。

1.2 主要試劑 pMD19-T (simple)載體、Premix ExTaqTMDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶NotⅠ、XhoⅠ、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、Premix ExTaqTM、DNA Ligation Kit、3'-Full RACE Core Set、Prime ScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)、E.coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞均購自TaKaRa 公司；DNA提取、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；TRIzolReagent 購自ThermoFisher 公司；Annealing Buffer for DNA Oligos (5×)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 購自Roche 公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(DLRA)購自Promega 公司。Lipofectamine 2000 購自Invitrogen 公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液(0.25 %)、DMEM、DEPC 水均購自Solarbio 公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 采用Primer Premier 5.0 軟件，根據(jù)前期預(yù)測的宿主各候選靶基因序列(未發(fā)表文章)，設(shè)計3'-UTR 的引物對(1～6)、寡核苷酸互補(bǔ)引物對(7～12)，以及用于qRT-PCR 的引物對(13～19)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成(表1)。

1.4 宿主候選靶基因cDNA 文庫的構(gòu)建 依照TRIzol 試劑說明書提取CEF 細(xì)胞總RNA，按照3'-Full RACE Core Set 試劑說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，按照試劑盒說明書進(jìn)行兩輪PCR 反應(yīng)。首先以miR-M31-3p 特異性反向互補(bǔ)引物(5'-RGCRACAGRCGRGAGCAGARCAA-3'，“R”為“G”或“A”)為上游引物、試劑盒中所帶3'-RACE Outer Primer (5'-TACCGTCGTTCCACTAGTAGTGAT TT-3')為下游引物，進(jìn)行第一輪PCR 擴(kuò)增。然后用上述miR-M31-3p 特異性反向互補(bǔ)引物為上游引物、試劑盒中所帶3'-RACE Inner Primer (5'-CGCGGATC CTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3')為下游引物；以第一輪PCR 產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR 擴(kuò)增。最終的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分析后割膠回收并純化100 bp～1 000 bp 的PCR 產(chǎn)物，分別連接至pMD19-T 載體后轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單克隆搖菌，分別利用miR-M31-3p 特異性反向互補(bǔ)引物和3'-Full RACE Inner 引物進(jìn)行菌液PCR 鑒定，陽性菌液由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果利用BLAST 軟件進(jìn)行對比分析，最終確定候選靶基因的序列和名稱。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequence and fragment length

1.5 雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以1.4 中cDNA 作為模板，以表1 中所示的相應(yīng)基因引物對(1～6)擴(kuò)增雞的候選基因磷酸二羥基丙酮酰基轉(zhuǎn)移酶(Glyceronephosphate O-acyltransferase， GNPAT)、轉(zhuǎn)錄因子12 (Transcription factor 12，TCF12)、胞質(zhì)非特異性肌肽酶2 (Carnosine dipeptidase 2，CNDP2)、微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶1 (Microsomal glutathioneS-transferase 1，MGST1)、凋亡相關(guān)基因CD99 分子樣蛋白 2 (CD99 molecule-like 2， CD99L2)以及FIGNL1 3'-UTR 等基因片段。PCR 產(chǎn)物膠回收后分別克隆至pMD19-T 載體，并轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆搖菌提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，然后陽性質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ/NotⅠ酶切后純化回收目的片段，二次克隆至psiCHECKTM-2 載體構(gòu)建野生型候選雙熒光素酶報告質(zhì)粒， 分別命名為psiCHECK-GNPAT-3'-UTR、psiCHECK-TCF12-3'-UTR、psiCHECK-CNDP2-3'-UTR、psiCHECK-MGST1-3'-UTR、 psiCHECK-FIGNL1-3'-UTR 和 psiCHECKCD99L2-3'-UTR。上述質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增和XhoⅠ/NotⅠ雙酶切鑒定，符合預(yù)期的陽性菌由上海生工生物工程股份有限公司測序。將表1 所示的寡核苷酸引物對(7～12)分別用ddH2O 溶解至終濃度為50 μmol/μL，進(jìn)行退火反應(yīng)。反應(yīng)體系為：DEPC 水40 μL，退火緩沖液(5×)20 μL，正向和反向引物各20 μL；反應(yīng)程序設(shè)為95 ℃變性2 min，后每隔1 min 下降1 ℃，直至降至25 ℃為止，形成寡核苷酸互補(bǔ)鏈，然后XhoⅠ/NotⅠ酶切后定向插入psiCHECKTM-2 載體，構(gòu)建上述6 個候選靶基因3'-UTR 突變體的雙熒光素酶報告質(zhì)粒，分別命名為psiCHECK-mut-GNPAT-3'-UTR、 psiCHECK-mut-TCF12-3'-UTR、 psiCHECK-mut-CNDP2-3'-UTR、psiCHECK-mut-MGST1-3'-UTR、psiCHECK-mut-CD99L2-3'-UTR 和 psiCHECK-mut-FIGNL1-3'-UTR，同上述方法鑒定后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.6 雙熒光素酶報告實驗(Dual luciferase reporter assay，DLRA)將293T 細(xì)胞鋪至48 孔板，待細(xì)胞匯合度約80 %時，將1.5 中構(gòu)建的包含野生型和突變型雙熒光素酶報告質(zhì)粒分別與pcDNA6.2-miR-neg、pcDNA6.2-miR-M31 和pcDNA6.2-mut-miR-M31以每種質(zhì)粒各300 ng 兩兩組合后，利用Lipofectamine 2000 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，利用DLRA 進(jìn)行檢測。每個轉(zhuǎn)染分別做3 個重復(fù)，計算海腎熒光素酶/螢火蟲熒光素酶活性的比值，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7 qRT-PCR 分析候選靶基因的轉(zhuǎn)錄水平 常規(guī)方法制備CEF 細(xì)胞單層，按照X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 使用說明書分別將pcDNA6.2-miR-neg、pcDNA6.2-miR-M31 和pcDNA6.2-mut-miR-M31 轉(zhuǎn)染CEF 細(xì)胞，進(jìn)行miRNA 過表達(dá)，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h 收集細(xì)胞備用。另外采用MDV GX0101 株和GXΔmiR-M31 株分別感染CEF單層細(xì)胞，以未感染CEF 細(xì)胞作為陰性對照，于病毒感染后72 h、96 h 和120 h 分別收集細(xì)胞備用。分別提取上述CEF 細(xì)胞樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用表1 所示的引物對(13 ～19)進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95 ℃5 min、95 ℃15 s、60 ℃30 s，共40 個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法統(tǒng)計分析相關(guān)數(shù)據(jù)，比較分析檢測上述6 個候選靶基因在miR-M31-3p 過表達(dá)和MDV 感染CEF 細(xì)胞中的相對轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié) 果

2.1 宿主候選靶基因的cDNA 文庫構(gòu)建及篩選結(jié)果利用雜交PCR 構(gòu)建與miR-M31-3p 互作的宿主候選靶基因cDNA 文庫，對共計946 個文庫菌落進(jìn)行PCR 鑒定。隨機(jī)挑選360 個陽性克隆菌落測序(占PCR 菌落篩選總樣38 %)，并進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果顯示其中有159 個克隆可在以NCBI 中找到對應(yīng)基因序列，排除重復(fù)序列后共獲得77 種宿主基因，其中49 個與miR-M31-3p 互作的宿主基因的靶點(diǎn)位于3'-UTR 中，經(jīng)分析確定6 個候選靶基因，分別為雞GNPAT、TCF12、FIGNL1、CNDP2、MGST1和CD99L2 靶基因(表2)。

2.2 雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果 以CEF 細(xì)胞cDNA 為模板，用PCR 分別擴(kuò)增候選靶基因CNDP2、FIGNL1、GNPAT、CD99L2、MGST1 和TCF12 的3'-UTR 基因片段，結(jié)果顯示PCR 產(chǎn)物大小均與預(yù)期相符(圖1A)。將這些基因片段回收純化后定向插入到psiCHECKTM-2 載體，酶切鑒定(圖1B)以及測序分析結(jié)果與預(yù)期一致。表明正確構(gòu)建了上述候選靶基因的野生型3'-UTR 雙熒光素酶報告質(zhì)粒。同上，將人工合成的6 對突變型3'-UTR 引物退火形成雙鏈，定向插入到psiCHECKTM-2 載體，雙酶切測序結(jié)果表明構(gòu)建6 個候選靶基因的突變型3'-UTR 雙熒光素酶報告質(zhì)粒(圖略)。

2.3 DLRA 分析miR-M31-3p 與候選靶基因的相互作用結(jié)果 將各突變型和野生型3'-UTR 雙熒光素酶報告質(zhì)粒分別與pcDNA-miR-M31、pcDNA-miR-neg或pcDNA-mut-miR-M31 兩兩組合后轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后36 h 利用DLRA 檢測，計算海腎熒光素酶活性值/螢火蟲熒光素酶活性值的比值，結(jié)果顯示，CNDP2，F(xiàn)IGNL1，GNPAT，CD99L2，MGST1，TCF12 基因各實驗組比值分別為：0.29，0.78，0.81，0.61，0.48，0.62，而各組內(nèi)對照組比值接近于1 (0.97 ～0.98)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示CNDP2、FIGNL1、CD99L2、TCF12 和MGST1 被極顯著抑制(p<0.01)，GNPAT 被顯著抑制(p<0.05)(圖2)。表明miR-M31-3p 在體外可靶向結(jié)合上述6 個基因的3'-UTR，并且這種結(jié)合具有序列特異性。

表2 miR-M31-3p 候選靶基因相關(guān)信息以及作用靶點(diǎn)分析Table 2 Information of target candidates and their corresponding binding sites of miR-M31-3p

圖1 候選靶基因3'-UTR 的PCR 擴(kuò)增(A)及其重組質(zhì)粒(B)的雙酶切鑒定Fig.1 Amplification of target gene 3'-UTRs (A)and identification of the recombinant plasmid (B)by double enzyme digestion

圖2 DLRA 分析miR-M31-3p 與宿主候選靶基因的3'-UTR 在體外的相互作用Fig.2 Analysis of the in vitro interaction between the miR-M31-3p and the 3'-UTRs of host target genes utilizing DLRA

2.4 qRT-PCR 檢測宿主靶基因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平CEF 在分別轉(zhuǎn)染pcDNA-miR-M31 和pcDNA-mut-miR-M31 后24 h、48 h 收集樣品，利用qRT-PCR檢測靶基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后48 h 時各組內(nèi)對照組mRNA 水平相對數(shù)值均接近1(0.97～0.99)，而pcDNA-miR-M31 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CNDP2、FIGNL1、 GNPAT、 CD99L2、 MGST1、 TCF12 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平相對數(shù)值分別為0.71，0.75，0.75，0.72，0.71，0.77，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示CNDP2、GNPAT 被顯著抑制(p<0.05)，F(xiàn)IGNL1、CD99L2、TCF12 和MGST1 被極顯著抑制(p<0.01)，但pcDNA-mut-miR-M31 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中上述基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平則顯著恢復(fù)(圖3)。表明宿主各靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著下調(diào)。

圖3 qRT-PCR 分析過表達(dá)miR-M31-3p 的CEFs 中候選宿主靶基因的mRNA 的相對轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Relative transcriptional levels of candidate host target genes mRNA in miR-M31-3p overexpressed CEFs determined by RT-qPCR

在病毒感染實驗中，在感染MDV GX0101 株和GXΔmiR-M31 株72 h、96 h、120 h 時利用qRT-PCR分別檢測各組mRNA 轉(zhuǎn)錄水平相對數(shù)值，具體結(jié)果見圖4，其中感染120 h 后各組內(nèi)對照組mRNA 轉(zhuǎn)錄水平相對數(shù)值接近于1 (0.98～0.99)，而CNDP2、FIGNL1、GNPAT、CD99L2、MGST1、TCF12 基因在MDV 感染時mRNA 轉(zhuǎn)錄水平相對數(shù)值分別為0.27、0.60、0.21、0.93、0.72、0.63。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，與CEF 陰性對照相比，除CD99L2 基因之外，在感染MDV GX0101 株的細(xì)胞中CNDP2、GNPAT、TCF12、MGST1、FIGNL1 基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在120 h 時均顯著下調(diào)(p<0.01)，而感染GXΔmiR-M31 的細(xì)胞中上述基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平則顯著恢復(fù)(圖4)。表明miR-M31-3p 在體內(nèi)可靶向調(diào)控并顯著抑制宿主CNDP2、GNPAT、TCF12、MGST1 和FIGNL1 各基因的轉(zhuǎn)錄水平。CD99L2 基因在DLRA、過表達(dá)miRNA 的CEF 細(xì)胞中其轉(zhuǎn)錄水平均可以被miR-M31-3p 抑制表達(dá)，但在病毒感染的CEF 細(xì)胞中，其mRNA 轉(zhuǎn)錄水平并無顯著變化，這可能因為病毒感染后在多種細(xì)胞因子綜合作用下使宿主細(xì)胞內(nèi)CD99L2 基因不表現(xiàn)下調(diào)。

圖4 qRT-PCR 分析GX0101 和GXΔmiR-M31 感染的CEF 細(xì)胞中靶基因mRNA 的相對表達(dá)水平Fig.4 Relative transcriptional levels of host target genes in GX0101 or GXΔmiR-M31 infected CEFs determined by qRT-PCR

3 討 論

最新研究發(fā)現(xiàn)，MDV 編碼的miRNA 參與MD腫瘤發(fā)生，如敲除miR-M4-5p 的MDV 致病和致瘤能力顯著減弱[10]，miR-M4-5p 還可通過下調(diào)LTBP1(Latent TGF-β binding protein 1)的表達(dá)來抑制TGF-β信號通路的傳遞，進(jìn)而激活宿主原癌基因c-Myc 的表達(dá)，最終促進(jìn)MD 腫瘤的發(fā)生[5]。miR-M31-3p 與宿主miR-221 具有相同的種子序列，后者靶向調(diào)控p27Kip1 蛋白的表達(dá)。p27Kip1 是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，該蛋白的下調(diào)促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和增殖[11]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)缺失miR-M31 可以降低MDV 感染雞的死亡率和腫瘤發(fā)生率[9]，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究利用雜交PCR 法構(gòu)建與miR-M31-3p 互作的宿主靶基因cDNA 文庫，共篩選到49 個miRNA 結(jié)合靶點(diǎn)位于宿主靶基因3'-UTR，進(jìn)一步測序分析篩選發(fā)現(xiàn)，miR-M31-3p 與CNDP2、GNPAT、CD99L2、MGST1、TCF12 以及FIGNL1 基因的3'-UTR 均存在相互作用，后續(xù)過表達(dá)試驗證實miR-M31-3p 可以抑制全部6 個基因的表達(dá)。同時在MDV 感染實驗中，除CD99L2 基因之外，CNDP2、GNPAT、MGST1、TCF12 和FIGNL1 基因的轉(zhuǎn)錄水平均可被miR-M31-3p 極顯著抑制。這些結(jié)果證實CNDP2、GNPAT、MGST1、TCF12 和FIGNL1 為與miR-M31-3p 互作的宿主靶基因。

在這些宿主靶基因中，MGST1 是一種膜結(jié)合的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，與機(jī)體解毒過程有關(guān)，是抵抗機(jī)體因有害作用產(chǎn)生的活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)所必須的。細(xì)胞內(nèi)高水平的活性氧(ROS)被認(rèn)為是導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡的主要原因之一[12-13]，因此MGST1 常被作為細(xì)胞應(yīng)對活性中間體的一部分從而保護(hù)細(xì)胞免受死亡[14]。miR-M31-3p 靶向作用MGST1，預(yù)示其具有抑制腫瘤發(fā)展的潛能。CNDP2的異常表達(dá)可以顯著抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯[15]。另外CNDP2 的敲除可以抑制表皮生長因子受體、細(xì)胞周期蛋白B1 和E 的表達(dá)，表皮生長因子受體通常促進(jìn)細(xì)胞的生長發(fā)育，一旦發(fā)生基因異常表達(dá)，細(xì)胞可能不受控制地生長[16]。miR-M31-3p 對CNDP2 的負(fù)調(diào)控可能也會使細(xì)胞不受限制的增長。CD99L2 是一種表達(dá)于白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及其它類型細(xì)胞的I 型糖蛋白[17]，與炎癥條件下嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞的外滲有關(guān)[18]。CD99L2 是白細(xì)胞外滲所必需的[19]，白細(xì)胞從血液滲出到炎癥部位是先天性免疫的關(guān)鍵步驟，miR-M31-3p 作用于CD99L2 可能對白細(xì)胞的滲出有影響，使宿主免疫失調(diào)。FIGNL1 編碼的蛋白是一種中心體蛋白，能夠抑制細(xì)胞纖毛形成[20]，而且還參與細(xì)胞核中DNA 的修復(fù)[21]，其可能與細(xì)胞癌變有關(guān)。TCF12 是一種轉(zhuǎn)錄因子，所編碼的蛋白是bHLH 蛋白家族的一個成員，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和入侵[22]。miR-M31-3p 對這些宿主靶基因的調(diào)控，進(jìn)一步驗證了本實驗室前期報道的其與MD腫瘤發(fā)生的密切關(guān)系，也為后續(xù)揭示miR-M31-3p調(diào)控MDV 感染及致癌的機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。