馬美哥，于蒙蒙，許傳田，黃慶華，孟照潔，王素艷，邢立曉，常芳芳，李 猷，何希君，劉長軍，祁小樂，王永強(qiáng)，孫延鳴，王笑梅，高玉龍

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽免疫抑制病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱150069；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832003；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100；4.山東和康源生物育種股份有限公司，山東濟(jì)南271018)

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup，ALV)引起禽類的多種惡性或良性腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，以在成年雞中產(chǎn)生淋巴樣腫瘤和產(chǎn)蛋量下降為主要特征。J 亞群ALV (ALV-J)是近年來一種致病性更強(qiáng)和傳播能力更快的新的外源性ALV，主要引起肉用型雞發(fā)生骨髓細(xì)胞瘤[1]。由于AL 危害嚴(yán)重，被《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012 年～2020 年)》 列為優(yōu)先防控的動(dòng)物疫病。由于該病是重要的種源性疾病，也被《全國獸醫(yī)衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2016 年～2020 年)》列為重點(diǎn)凈化的家禽疫病。經(jīng)過近些年的持續(xù)凈化，國內(nèi)AL 得到了較好的控制，尤其在蛋種雞場的發(fā)生率逐年降低，但目前在部分地方品種雞群仍有感染和流行[2]。

目前我國白羽肉雞祖代雞主要依靠進(jìn)口，進(jìn)口肉種雞的種源安全除了直接關(guān)系到我國雞肉產(chǎn)品安全生產(chǎn)外，也對(duì)國內(nèi)家禽生物安全帶來很大挑戰(zhàn)[3-4]。2018 年以來，遼寧、山東等地某品種進(jìn)口白羽肉種雞發(fā)生了嚴(yán)重的疑似AL 病例，主要發(fā)生在17 周齡～19 周齡的父母代肉種雞，導(dǎo)致種蛋孵化率下降，大量肉種雞被淘汰，損失非常嚴(yán)重。為了分析引起該次白羽肉種雞發(fā)病的病原，本研究從白羽肉種雞發(fā)病雞場采集疑似病料樣品，通過病理切片、病毒分離、病毒亞群鑒定等試驗(yàn)，證實(shí)所有分離株均屬于ALV-J，確診了引起該次白羽肉種雞發(fā)病的病原。

1 材料與方法

1.1 病料樣品與細(xì)胞 2018 年5 月～7 月，山東、遼寧等地的白羽肉種雞父母代場出現(xiàn)了疑似AL 病例，發(fā)病日齡多在17 周齡～19 周齡，可見病雞肝脾腫大，肝破裂，肝脾有腫瘤，發(fā)病率高達(dá)30 %。從發(fā)病場先后采集6 批共55 份病雞肝、脾、腎等組織臟器樣品。用于病毒分離培養(yǎng)的DF-1 細(xì)胞以及大腸桿菌感受態(tài)DH5a 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。用于鑒別ALV 亞群的多重PCR 的A、B 和J 亞群ALV 陽性對(duì)照質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存[6]。

1.2 主要試劑 Ex DNA 聚合Taq酶、pMD18-T 載體、DL2000 DNA Marker 均購自TaKaRa 公司；DNA 提取及膠回收試劑盒購自AXYGEN 公司；ALV p27 抗原檢測試劑盒購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.3 病理剖檢與組織切片的觀察 對(duì)疑似發(fā)生腫瘤病的進(jìn)口白羽肉種雞剖檢，觀察其器官病變。取病雞的肝臟和脾臟樣品參照徐鑌蕊等[5]的方法制備病理組織切片，HE 常規(guī)染色后，二甲苯樹膠封固，顯微鏡下觀察切片。

1.4 腫瘤病病原的檢測 將發(fā)病雞的肝臟和脾臟病料樣品，至研缽中充分研磨，離心后取上清，按試劑盒的方法提取其基因組DNA，以其為模板，采用ALV 多重PCR 引物及馬立克氏病病毒(MDV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)特異性引物[6-7]，對(duì)ALV、MDV 及REV 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.5 ALV 亞群的鑒定與序列分析 將1.4 中鑒定為ALV 陽性的病料樣品上清經(jīng)0.22 μm 的濾器過濾除菌，接種于70 %～80 %單層的DF-1 細(xì)胞，按常規(guī)方法培養(yǎng)盲傳2 代，收獲DF-1 細(xì)胞上清用于ALV p27 抗原的檢測，檢測為ALV 陽性的細(xì)胞上清提取其DNA 用于鑒別ALV 亞群的多重PCR 檢測[6]，同時(shí)設(shè)A、B 和J 亞群ALV 質(zhì)粒作為陽性對(duì)照[6]。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并克隆于pMD18-T 載體，經(jīng)PCR 鑒定正確后由吉林省庫美生物科技有限公司測序。利用DNAStar 中SeqMan 軟件對(duì)序列進(jìn)行剪輯、拼接，并利用MegAlign 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，與國內(nèi)外不同亞群ALV 病毒株序列進(jìn)行比對(duì)與遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 病理剖檢與組織切片觀察 剖檢后可見病雞肝臟顯著腫大，表面彌漫著大量細(xì)小的白色增生性結(jié)節(jié)，肝臟周圍有充滿血液的囊泡狀物，類似血管瘤，在脊椎、骨膜處有肉瘤樣贅生物。

組織切片觀察顯示，與正常肝組織切片相比，發(fā)病雞肝實(shí)質(zhì)中存在彌漫性或局灶性髓細(xì)胞樣瘤細(xì)胞浸潤。肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝索消失或排列紊亂，殘余肝細(xì)胞變性、壞死。脾實(shí)質(zhì)內(nèi)可見團(tuán)塊狀增殖的腫瘤細(xì)胞，伴有部分腫瘤細(xì)胞壞死(圖1)。

圖1 發(fā)病雞肝臟、脾臟的病理組織學(xué)變化(HE 染色)Fig.1 Pathological changes of liver and spleen of diseased chickens(HE staining)

2.2 腫瘤病病原檢測結(jié)果 提取55 份病料樣品的總DNA，利用ALV、MDV、REV 的特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示ALV 陽性樣品12 份，陽性率為21.8%，MDV 陽性樣品1 份，陽性率為1.82%，REV 均為陰性。表明引起進(jìn)口白羽肉種雞發(fā)病的病原主要為ALV。

2.3 ALV 亞群的鑒定結(jié)果 將12 份經(jīng)PCR 擴(kuò)增為ALV 陽性的病料樣品接種DF-1 細(xì)胞培養(yǎng)，盲傳2代，收集細(xì)胞上清，利用ALV p27 抗原ELISA 試劑盒檢測(判斷標(biāo)準(zhǔn)：S/P 值>0.2 為陽性，S/P 值≤0.2為陰性)。結(jié)果顯示，有8 株病毒細(xì)胞上清呈陽性(S/P 值為0.399～2.208)，另外4 份細(xì)胞上清ELISA檢測結(jié)果呈陰性，整個(gè)過程細(xì)胞狀態(tài)良好，推測可能是該4 份病料樣品中病毒含量太低，導(dǎo)致病毒接種DF-1 細(xì)胞后未增殖起來。結(jié)果呈陽性的8 株病毒分別命名為：SD1801、SD1802、SD1804、SD1805、SD1806、SD1807、SD1808 及SD1809。

分別提取8 個(gè)分離株細(xì)胞上清的前病毒DNA，以其為模板，進(jìn)行ALV 亞群的多重PCR 檢測，結(jié)果顯示，8 個(gè)分離株均擴(kuò)增出與ALV-J 相對(duì)應(yīng)的約422 bp 的目的條帶(圖2)，初步表明，8 個(gè)分離株均為ALV-J。

圖2 分離的8 株ALV 多重PCR 檢測結(jié)果Fig.2 The detection result of the 8 isolates by multi-PCR detection

2.4 序列分析結(jié)果 將2.3 擴(kuò)增得到的約422bp 的ALV-J 特異性基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序結(jié)果顯示，8 個(gè)分離株之間同源性為99.5 %～100 %，與A、B、C、D 亞群ALV 的同源性僅為56.5 %～58.8 %，與ALV-J 的同源性最高，為90.7 %～96.6 %。遺傳進(jìn)化分析顯示，8 個(gè)分離株與ALV-J 屬于同一分支(圖3)。表明8 個(gè)分離株均屬于ALV-J。該結(jié)果與多重PCR 檢測結(jié)果一致，綜合病理剖檢與組織切片觀察、雞群臨床癥狀及多重PCR 檢測結(jié)果，進(jìn)一步確定了引起進(jìn)口白羽肉種雞發(fā)生嚴(yán)重腫瘤病的病原為ALV-J。

近年來，雖然蛋雞發(fā)生了嚴(yán)重的AL[8-11]，但白羽肉雞很少有ALV-J 流行的報(bào)道。2018 年以來山東某些白羽父母代肉種雞發(fā)生了嚴(yán)重的AL，該次發(fā)病雞主要是不同地區(qū)多個(gè)養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的進(jìn)口某品種肉種雞，雖然發(fā)病地域和雞場不同，但這些雞場均是從國外某個(gè)品種白羽祖代肉雞場引進(jìn)的父母代肉種雞，品種相同，來源相同，所以從這些發(fā)病特點(diǎn)來看，很可能是由于該品種的白羽祖代肉雞感染了ALV。該次AL 疫情發(fā)病率高、范圍廣，是近年來我國白羽肉種雞發(fā)病最為嚴(yán)重的一次。該次所有發(fā)病雞場的種雞均來源于同一個(gè)品種的白羽祖代肉雞場，盡管祖代雞AL 來源還沒有確定，但根據(jù)ALV的傳播特點(diǎn)，其與祖代雞引進(jìn)很可能有極大的關(guān)系，建議有關(guān)部門，將AL 等種源性疾病納入到進(jìn)口祖代雞的必檢項(xiàng)目，嚴(yán)把進(jìn)口種源疫病關(guān)，防止疫病隨進(jìn)口動(dòng)物傳入我國，影響我國的動(dòng)物安全生產(chǎn)。

圖3 分離的8 株ALV 特異性基因序列遺傳進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ALV-J specific genes of 8 isolates