谷 巍，孫明杰，王麗榮，陳 振，曾佳佳，陳 靜，徐海燕，單寶龍，王春鳳

(1.山東寶來利來生物工程股份有限公司山東省動物微生態(tài)制劑省級重點實驗室，山東泰安271000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學與技術(shù)學院/吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林長春130118)

發(fā)酵是中藥材傳統(tǒng)炮制方法之一。對中藥發(fā)酵，在提高藥物效能、產(chǎn)生新的化合物、降低藥物毒性等方面具有顯著優(yōu)勢[1]。劉穎等研究表明中藥天龍發(fā)酵后可增強其對肺腺癌A549 細胞的抑制作用[2]。Xing 等研究表明真菌G.luteus發(fā)酵丹參能夠顯著提高其抗氧化活性和總酚含量[3]。孫佳彬等比較發(fā)酵前后半夏的毒性和刺激性變化，發(fā)酵后的半夏比未發(fā)酵半夏對家兔眼結(jié)膜的刺激性明顯減弱，發(fā)酵可以緩和半夏的刺激性[4]。本實驗以具有澀腸、止瀉、抑菌、消炎作用的3 味中藥組成中藥復(fù)方，經(jīng)嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方后，利用高效液相色譜(HPLC)對中藥復(fù)方發(fā)酵前后成分的變化進行比較、分析。以大腸桿菌K88 引起的腹瀉小鼠為實驗對象，對比研究中藥復(fù)方發(fā)酵液與中藥復(fù)方水提液對腹瀉小鼠的影響，為中藥復(fù)方發(fā)酵液深入應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 中藥復(fù)方由烏梅、五倍子、蒲公英組成，烏梅、蒲公英由山東舜生堂中藥飲片有限公司生產(chǎn)，質(zhì)量標準符合《中國藥典》 (2010 年版)，生產(chǎn)批號1507402，1409377；五倍子由亳州市貢藥飲片廠生產(chǎn)，質(zhì)量標準符合《中國藥典》(2015版一部)，生產(chǎn)批號為20151201。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。嗜酸乳桿菌由山東寶來利來生物工程股份有限公司生物研究院分離，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏專利號：201102872925。甲醇、磷酸、磷酸二氫銨、乙腈，色譜純，均購自天津凱通。100 只6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠，雌雄各半，購自山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)201400077。MRS 乳酸菌液體培養(yǎng)基、LBS乳酸菌固體培養(yǎng)基、EMB 腸桿菌、和BS 雙歧桿菌培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。IFN-γ、IL-4 試劑盒購自山東邦奕生物科技有限公司。

1.2 中藥復(fù)方發(fā)酵液成分變化的測定 中藥復(fù)方水提液制備：中藥蒲公英、烏梅、五倍子烘干，磨粉，過80 目篩，按蒲公英、烏梅、五倍子6∶1∶1 比例精確稱取，傳統(tǒng)水煎炮制方法，提取40 min，65 ℃烘干。精確稱取8 g 烘干粉末置于100 mL 嗜酸乳桿菌菌液中，超聲震蕩30 min，即為中藥復(fù)方水提液。

中藥復(fù)方發(fā)酵液制備：中藥蒲公英、烏梅、五倍子烘干，磨粉，過80 目篩，按蒲公英、烏梅、五倍子6∶1∶1 比例精確稱取8 g 烘干粉末置于100 mL MRS 液體培養(yǎng)基中接種嗜酸乳桿菌液(3×109cfu/mL)4 mL，37 ℃，發(fā)酵24 h 即為中藥復(fù)方發(fā)酵液。

采用HPLC 測定不同發(fā)酵時間點的色譜峰，比較主要色譜峰的變化。發(fā)酵過程中從開始，每小時取發(fā)酵液2 mL，共取13 次發(fā)酵液，均置于4 ℃保存。取樣結(jié)束后所有樣品12 000 r/min 離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，濾液為待測液。

1.3 實驗動物分組及處理 按基礎(chǔ)日糧預(yù)飼實驗小鼠3 d 后隨機分為4 組：發(fā)酵組、水提組、模型對照組、空白對照組，每組24 只，雌雄各半。將1.2制備的中藥復(fù)方發(fā)酵液和中藥復(fù)方水提液濃縮后凍干制備凍干粉，分別按0.4 g/只/d 添加于基礎(chǔ)日糧，制備成中藥發(fā)酵鼠糧和中藥水提鼠糧?；A(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)成分參考文獻[5]。分組后即開始飼喂試驗，模型對照組和空白對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，發(fā)酵組飼喂中藥發(fā)酵鼠糧，水提組飼喂中藥水提鼠糧，持續(xù)飼喂7 d 結(jié)束試驗。飼喂期間，第1 d～4 d除空白對照組外其余3 組灌胃林可霉素(15 mg/mL)和頭孢曲松鈉(25 mg/mL)兩種抗生素，破壞腸道正常菌群平衡[6]，0.3 mL/次/只，2 次/d，第5 d 腹腔注射大腸桿菌K88 菌懸液0.3 mL/只(2.7×108cfu/mL)。空白對照組灌胃和注射等量鹽水。腹腔注射后開始觀察小鼠腹瀉情況，統(tǒng)計直至第7 d 試驗結(jié)束。動物飼養(yǎng)室溫20 ℃～25 ℃，濕度55 %～65 %。

1.4 小鼠腹瀉率和腹瀉指數(shù)的統(tǒng)計 在試驗第5 d，腹腔注射大腸桿菌菌懸液前，每組各取10 只小鼠，單籠飼養(yǎng)管理。在小鼠腹腔注射大腸桿菌第6 h、24 h、27 h、36 h 時根據(jù)參考文獻觀察統(tǒng)計每只小鼠是否腹瀉、總便數(shù)、稀便數(shù)、稀便級別，計算腹瀉率和腹瀉指數(shù)[7]。

1.5 小鼠免疫器官指數(shù)的測定 試驗結(jié)束(第7 d)，對小鼠稱重后斷頸迫殺，剝離脾臟、胸腺、肝臟，分別稱重，計算免疫器官指數(shù)。脾臟指數(shù)= 脾臟重量(g)/體重(g)×100，胸腺指數(shù)、肝臟指數(shù)計算方法與上述計算方法相同。

1.6 小鼠腸道菌群的測定 飼喂7 d 試驗結(jié)束時，斷頸迫殺小鼠。無菌采集小鼠盲腸內(nèi)容物，用無菌生理鹽水倍比稀釋，將不同稀釋度的0.1 mL 稀釋液涂布于各種鑒別培養(yǎng)基上：EMB 培養(yǎng)基用于鑒別大腸桿菌，37 ℃有氧培養(yǎng)24 h 后進行菌落計數(shù)；LBS和BS 培養(yǎng)基用于鑒別嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌，37 ℃培養(yǎng)48 h 后進行菌落計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果用每克腸道內(nèi)容物鮮樣中細菌個數(shù)的對數(shù)lg (cfu/g)表示。

1.7 小鼠細胞因子IFN-γ、IL-4 的測定 試驗第5 d，腹腔注射大腸桿菌前、注射后2 h、24 h、36 h 取1.4 單籠飼養(yǎng)的10 只小鼠斷尾采血，冷藏過夜，4 000 r/min，離心10 min，分裝血清，用試劑盒分別檢測小鼠血清IFN-γ、IL-4 表達水平，計算IFN-γ/IL-4 的比值。

1.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)方差分析，顯著差異者用LSD 方法進行多重比較，結(jié)果均用平均值±標準差表示。

2 結(jié) 果

2.1 中藥復(fù)方發(fā)酵液成分變化測定 HPLC 測定發(fā)酵液樣品0～12 h 發(fā)酵過程中每小時色譜圖變化情況，從0～12 h 測定的13 個色譜圖中選定3 h、6 h、8 h、12 h 樣品色譜圖疊加。結(jié)果表明發(fā)酵12 h 內(nèi)，在保留時間為16 min (發(fā)酵前色譜峰)和10.5 min(發(fā)酵后色譜峰)出現(xiàn)主要的兩個特征吸收峰的變化。發(fā)酵前色譜峰不斷降低，發(fā)酵后色譜峰不斷升高，兩個峰處于此消彼長的變化趨勢(圖1)。表明兩個主要吸收峰對應(yīng)的兩種物質(zhì)存在轉(zhuǎn)化關(guān)系。

圖1 3 h、6 h、8 h、12 h 中藥復(fù)方發(fā)酵液色譜疊加圖Fig.1 Chromatographic superposition diagram of fermentation broth for 3 h, 6 h, 8 h and 12 h

2.2 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠腹瀉率和腹瀉指數(shù)的影響 用抗生素連續(xù)給小鼠灌胃4 d 后腹腔注射大腸桿菌K88，觀察記錄小鼠各時間點腹瀉情況。結(jié)果顯示注射大腸桿菌后0～36 h 期間，模型對照組、發(fā)酵組與水提組3 組小鼠的腹瀉率均呈現(xiàn)降低趨勢，在36 h 時，發(fā)酵組腹瀉率最低(4%)，低于水提組(24 %)，模型對照組也存在自愈現(xiàn)象，但腹瀉率仍然較高(87.5 %)(圖2)。結(jié)果表明中藥復(fù)方發(fā)酵液能夠明顯降低小鼠的腹瀉率，對小鼠腹瀉有較好的治療作用，治療效果優(yōu)于中藥水提液。

圖2 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠腹瀉率的影響(%)Fig.2 Effect of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on diarrhea rate in diarrhea mice (%)

在小鼠腹腔注射大腸桿菌6 h、24 h、27 h 和36 h 時，觀察統(tǒng)計小鼠排便情況，計算腹瀉指數(shù)。結(jié)果顯示模型對照組腹瀉指數(shù)與空白對照組差異顯著(p<0.05)。在6 h 和24 h，中藥發(fā)酵組與水提組腹瀉指數(shù)差異不顯著(p>0.05)，但數(shù)值低于水提組。在27 h 和36 h，發(fā)酵組腹瀉指數(shù)顯著低于模型對照組和水提組(p<0.05)(表1)。結(jié)果表明，在降低腹瀉指數(shù)方面，中藥復(fù)方發(fā)酵液優(yōu)于中藥復(fù)方水提液。

表1 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠腹瀉指數(shù)的影響Table 1 Effect of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on diarrhea index in diarrhea mice

2.3 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠免疫器官的影響 試驗結(jié)束時，剖檢小鼠取其脾臟、胸腺、肝臟，稱重。結(jié)果顯示發(fā)酵組及水提組小鼠的免疫指數(shù)均高于空白對照組及模型對照組，且與模型對照組相比，發(fā)酵組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及肝臟指數(shù)分別提高了48.37 % (p<0.05)、29.57 % (p<0.05)、36.99 % (p<0.05)，且高于水提組。水提組相對于空白對照組略有升高，但未到達顯著性差異(圖3)。結(jié)果表明中藥復(fù)方發(fā)酵液能夠更好的促進免疫器官發(fā)育。

圖3 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠免疫器官的影響Fig.3 Effects of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on immune organs in diarrhea mice

2.4 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠腸道菌群的影響 試驗結(jié)束時，無菌采集小鼠盲腸內(nèi)容物，活菌計數(shù)測定盲腸中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌數(shù)量。結(jié)果顯示，注射大腸桿菌后36 h，與空白對照組相比，模型對照組大腸桿菌數(shù)量顯著升高(p<0.05)，雙歧桿菌數(shù)量顯著下降(p<0.05)，乳酸菌數(shù)量有所降低。表明注射大腸桿菌K88 后，腸道有害菌開始增殖，有益菌生長受到抑制。小鼠飼喂中藥后，發(fā)酵組和水提組大腸桿菌數(shù)量均與模型組相比顯著降低(p<0.05)，且發(fā)酵組大腸桿菌數(shù)量顯著低于水提組(p<0.05)，雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量顯著高于模型組(p<0.05)，且發(fā)酵組雙歧桿菌數(shù)量顯著高于水提組(p<0.05)，乳酸菌數(shù)量與水提組差異不顯著(p>0.05)(圖4)。結(jié)果表明飼喂中藥復(fù)方飼料能夠抑制大腸桿菌的生長，促進益生菌的生長，且發(fā)酵組優(yōu)于水提組。

圖4 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠腸道菌群的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on intestinal flora in diarrhea mice

2.5 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠血清IFN-γ 水平的影響 在小鼠腹腔注射大腸桿菌前(0)、后2 h、24 h、36 h 4 個時間點斷尾采血，分離血清。試劑盒測定不同時間點小鼠IFN-γ 含量。結(jié)果顯示IFN-γ 含量呈先下降后上升趨勢。注射大腸桿菌前(0)，發(fā)酵組與空白對照組差異不顯著(p>0.05)，水提組和模型對照組與空白對照組差異顯著(p<0.05)。注射大腸桿菌2 h 后，模型對照組、發(fā)酵組與水提組均低于空白對照組，且差異顯著(p<0.05)。注射24 h，發(fā)酵組與空白對照組差異顯著，其余各組與空白對照組差異不顯著。注射36 h 后各組間無顯著性差異(圖5)。結(jié)果表明發(fā)酵中藥在注射大腸桿菌前能夠抑制IFN-γ 的降低，在注射大腸桿菌后能促進IFN-γ 迅速提高，恢復(fù)平衡。

2.6 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠血清IL-4 水平的影響 在小鼠腹腔注射大腸桿菌前(0)、后2 h、24 h、36 h 4 個時間點斷尾采血，試劑盒測定不同時間點小鼠IL-4 含量。結(jié)果顯示不同時間點小鼠血清IL-4 含量呈先上升后下降趨勢。注射大腸桿菌前模型對照組與其它3 組均差異顯著(p<0.05)，而在注射大腸桿菌不同時間點，發(fā)酵組與水提組差異均不顯著(p>0.05)(圖6)。表明注射大腸桿菌后，IL-4 含量上升，中藥無論發(fā)酵與否均能抑制這種變化。

圖5 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠血清IFN-γ 水平的影響Fig.5 Effects of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on serum IFN-γ levels in diarrhea mice

圖6 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠血清IL-4 水平的影響Fig.6 Effects of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on serum IL-4 levels in diarrhea mice

2.7 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠血清IFN-γ/IL-4 的影響 根據(jù)已經(jīng)測定IFN-γ 和IL-4 含量，計算IFN-γ/IL-4。結(jié)果顯示發(fā)酵組IFN-γ/IL-4 更接近空白對照組，有降低IFN-γ/IL-4 比值向Th2 方向轉(zhuǎn)化。感染24 h 后，各組小鼠的IFN-γ/IL-4 不同程度升高，但發(fā)酵組能夠迅速提高IFN-γ/IL-4 比值，使其更接近空白對照組，使已經(jīng)發(fā)生的Th2 方向的轉(zhuǎn)化迅速恢復(fù)平衡(圖7)。表明中藥復(fù)方發(fā)酵液在調(diào)節(jié)細胞因子平衡方面優(yōu)于中藥復(fù)方水提液。

3 討 論

圖7 嗜酸乳桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方對腹瀉小鼠血清IFN-γ/IL-4 的影響Fig.7 Effects of Lactobacillus acidophilus fermentation of the compound on serum IFN-γ/IL-4 levels in diarrhea mice

中藥種類繁多，成分復(fù)雜，經(jīng)發(fā)酵后成分更難確定。中藥在畜牧行業(yè)中已經(jīng)有許多應(yīng)用[8-10]，但中藥發(fā)酵方面應(yīng)用報道較少。研究報道，中藥中的一些成分經(jīng)過發(fā)酵后含量增加1～4 倍，并且產(chǎn)生了某些新的特征吸收峰，同時發(fā)酵前的幾個特征吸收峰消失，但未明確新形成物質(zhì)和消失物質(zhì)間的關(guān)系[11]。本實驗在發(fā)酵過程中在保留時間為16 min 時產(chǎn)生了主要特征吸收峰，在10.5 min 產(chǎn)生了新的吸收峰，對0～12 h 間隔取樣的測定結(jié)果表明兩者確實存在此消彼長的轉(zhuǎn)化關(guān)系。發(fā)酵過程中，中藥成分的變化，會引起藥效的變化。如仲楨玉研究表明，葛根發(fā)酵后總成分減少，但降糖能力有所提高；天花粉發(fā)酵之后活性物質(zhì)含量和抗氧化降糖能力均優(yōu)于原料，發(fā)酵中藥復(fù)方產(chǎn)生了積極的作用[12]。Han 等對比研究了發(fā)酵苦參和非發(fā)酵苦參對LPS 誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎模型(EIU)的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可以提高苦參的抗炎作用[13]。本實驗研究表明發(fā)酵中藥復(fù)方成分的變化也對腹瀉小鼠產(chǎn)生了積極的影響。

動物試驗結(jié)果表明，中藥復(fù)方發(fā)酵液對腹瀉小鼠在腹瀉率、腹瀉指數(shù)、免疫器官指數(shù)、腸道菌群微生物、提高IFN-γ/IL-4 比值方面均優(yōu)于中藥復(fù)方水提液。盧偉等研究黃芩與鼠李糖乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物對仔豬大腸桿菌腹瀉治療效果表明，發(fā)酵產(chǎn)物組腹瀉率、糞便計分、腸病變程度均低于其它治療組[14]。李國忠研究表明芽孢桿菌發(fā)酵黃芩在提高仔豬免疫球蛋白方面顯著高于未發(fā)酵黃芩，TNF-α、IL-4 含量較空白組提高了90.7 %、78.3 %[15]。其有益效果的產(chǎn)生可能與中藥發(fā)酵物中的鼠李糖乳桿菌和發(fā)酵產(chǎn)物或芽孢桿菌及芽孢桿菌代謝物產(chǎn)生有關(guān)。本實驗在對其進行K88 所致腹瀉小鼠研究中，為了減少嗜酸乳桿菌及發(fā)酵產(chǎn)物對試驗效果的影響，將等量嗜酸乳桿菌發(fā)酵液濃縮后與中藥復(fù)方水提液混合凍干，減少益生菌及代謝產(chǎn)物的影響，說明中藥復(fù)方發(fā)酵液優(yōu)于中藥復(fù)方水提液，主要是因為中藥復(fù)方發(fā)酵后成分的變化。其中保留時間為16 min 時產(chǎn)生的主要特征吸收峰在嗜酸乳桿菌的發(fā)酵下，隨時間推移，發(fā)生了此消彼長的轉(zhuǎn)化，是發(fā)酵前后色譜峰的主要變化。因此推測這種轉(zhuǎn)變，是發(fā)酵后有效成分提升的原因。

蒲公英的主要成分為綠原酸、咖啡酸等[16]。烏梅主要成分為枸櫞酸、檸檬酸。五倍子的主要成分為單寧酸[17]。我國藥典中收載的五倍子鞣質(zhì)，稱為鞣酸(Tannic acid)，又叫單寧酸。五倍子的鞣質(zhì)含量很高，最高可達70 %以上。這3 種中藥中，具有轉(zhuǎn)化成分的為單寧酸。一個單寧分子與n 個水分子參加反應(yīng)，在酸性條件下，加熱水解得到一個葡萄糖分子(C6H12O6)和n 個(n 可能為6、7 或8)沒食子酸分子(C7H6O5)[18]。在工業(yè)上，沒食子酸主要由單寧酸的酸、堿、酶水解而來。因此推測，在發(fā)酵過程中的轉(zhuǎn)化可能為單寧酸與沒食子酸間的轉(zhuǎn)化。在之后試驗中，將烏梅、五倍子和蒲公英單獨用嗜酸乳桿菌發(fā)酵，確定了發(fā)酵前未知峰來源于五倍子。但以沒食子酸為標品，進行液相色譜分析時，其保留時間并未與未知峰重疊。因此未知峰的成分分析需要借助液質(zhì)連用色譜進一步分析。

烏梅、五倍子、蒲公英中藥復(fù)方經(jīng)嗜酸乳桿菌發(fā)酵后，中藥成分有所變化，其在降低產(chǎn)毒素大腸桿菌K88 引起的腹瀉小鼠的腹瀉指數(shù)和腹瀉率，提高小鼠免疫器官指數(shù)，修復(fù)腸粘膜并維持腸道菌群平衡，快速消除小鼠體內(nèi)炎癥方面，優(yōu)于中藥復(fù)方水提液，為開發(fā)防治因產(chǎn)腸毒素大腸桿菌所致的仔豬腹瀉相關(guān)中藥發(fā)酵產(chǎn)品提供實驗依據(jù)，也為其作用機理的深入研究提供參考。