路建彪，王俊麗，吳偉勝，司振書，李玉保

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252059)

禽大腸桿菌病是由某些致病性或條件致病性大腸桿菌引起，是危害養(yǎng)禽業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病之一，在疾病預(yù)防和治療過程中最易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致抗生素用量增加和禽類產(chǎn)品藥物殘留等一系列問題。該病一年四季均可發(fā)生，但以冬春季節(jié)和氣溫多變時期多發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。禽大腸桿菌病在臨床上主要通過抗生素防治，但由于抗生素的盲目添加或過量使用，導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥菌株不斷增多、耐藥譜不斷擴大，進而導(dǎo)致治療效果下降，養(yǎng)殖效益降低，同時對食品安全構(gòu)成威脅[1]。目前，大腸桿菌病仍是危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之一。因此基于養(yǎng)殖效益、食品安全和公共衛(wèi)生方面的考慮，尋找一種新的治療大腸桿菌病療效確實、無殘留、符合國家減抗或無抗養(yǎng)殖發(fā)展方向的抗菌制劑乃當(dāng)務(wù)之急[2]。

噬菌體作為細(xì)菌的天敵，可以裂解宿主菌，專一性強，高效，快速殺菌，不會感染畜禽機體，也不會產(chǎn)生耐藥性[3]。噬菌體主要感染細(xì)菌，對動物機體和人體安全，不污染環(huán)境[4]。噬菌體作為抗生素的替代品，已經(jīng)引起業(yè)內(nèi)專家和相關(guān)企事業(yè)單位的廣泛關(guān)注。本研究通過雞大腸桿菌噬菌體的分離及其生物學(xué)特性的測定、大腸桿菌病的治療試驗，為大腸桿菌病的防治和無抗養(yǎng)殖開辟新思路、新方法，也是畜禽疾病防治研究的一個方向。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 15 份雞新鮮糞便樣品采集自聊城地區(qū)某大型肉雞養(yǎng)殖場不同的雞舍；實驗用大腸桿菌E5 從上述病樣樣品中分離純化并保存于本實驗室；恩諾沙星溶液購自山東濰坊華英生物科技有限公司；硫酸慶大霉素購自河南正大動物藥業(yè)有新公司。

1.2 大腸桿菌噬菌體的分離及純化 參照文獻(xiàn)[3]從采集的15 份雞糞便樣品中進行噬菌體分離及純化。

1.3 噬菌體的生物學(xué)特性測定 將噬菌體裂解液10 倍倍比稀釋，雙層LB 培養(yǎng)基平板法培養(yǎng)噬菌體產(chǎn)生噬菌斑，選擇噬菌斑數(shù)量在30～300 個的平板，計算噬菌體的效價，計算公式為效價(pfu/mL)=pfu×稀釋倍數(shù)×10[3]。

取效價為2×1010pfu/mL 噬菌體裂解液0.5 mL分別放入溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃恒溫水浴鍋中，作用30 min 和60 min 時，檢測噬菌體效價，平行檢測3 次，取平均值。

取效價為2×1010pfu/mL 噬菌體裂解液0.1 mL與37 ℃預(yù)溫的各pH(pH4～11)LB 液體培養(yǎng)基0.9 mL混合，37 ℃恒溫水浴60 min，檢測噬菌體效價，平行檢測3 次，取平均值。

將MOI 分別為1 000、100、10、1、0.1 和0.01的噬菌體裂解液分別加入2.4×107cfu/mL 的大腸桿菌培養(yǎng)液中，37 ℃搖床中培養(yǎng)12 h，離心，0.22 μm濾膜過濾，并測定濾液中子代噬菌體的效價。各個比例重復(fù)做3 次，取平均值，以最高效價的MOI 作為最佳MOI[3]。

以最佳MOI 向試管中加入噬菌體和大腸桿菌，混合均勻，37 ℃溫浴15 min，離心，棄掉上清，用37 ℃的液體LB 培養(yǎng)基洗滌沉淀2 次，最后用37 ℃LB 液體培養(yǎng)基10 mL，重懸沉淀，迅速放入搖床中，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)。每隔10 min 測定噬菌體效價，平行檢測3 次，取平均值。以時間、效價對數(shù)值分別為橫、縱坐標(biāo)繪制曲線，即得噬菌體一步生長曲線。

1.4 雞大腸桿菌病的噬菌體治療試驗 將128 只健康的7 日齡817 肉雞隨機分為16 組，每組8 只，其中3 組為對照組，1 組為空白組，同時設(shè)恩諾沙星和硫酸慶大霉素治療組。連續(xù)飼喂168 h。除對照組2、對照組3、空白組外，其余各組分別腹腔注射大腸桿菌感染實驗雞，菌懸液濃度為2.4×108cfu/mL(經(jīng)細(xì)菌計數(shù)測定)，0.5 mL/只。按照最佳MOI，分別在注射大腸桿菌前6 h、3 h、0 注射后3 h、6 h，其中5 組口服噬菌體裂解液，5 組腹腔注射噬菌體裂解液，濃度為2.4×108pfu/mL，劑量為0.5 mL/只，對照組，0：對照1 為腹腔注射大腸桿菌、對照2 為腹腔注射噬菌體裂解液，對照3 為口服噬菌體裂解液?？股刂委熃M：0，口服10 %恩諾沙星注射液，0.1 mg/只；硫酸慶大霉素，1 萬單位/只，連喂3 d，1 次/d?？瞻捉M雞正常飼喂，不做任何處理。記錄各組雞只的狀態(tài)(疾病計分標(biāo)準(zhǔn)：1= 精神不振、閉眼、縮頭、采食下降等，2= 死亡，0= 正常)。致病指數(shù)=疾病計分/總分。

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌噬菌體分離純化 從采集的雞場糞便分離得到一株噬菌體，命名為Bp1805，經(jīng)過純化后得到的邊緣整齊、大小統(tǒng)一的透明的噬菌斑。對Bp1805 測定效價結(jié)果為2.4×1010pfu/mL。

2.2 噬菌體生物學(xué)特性測定 最適溫度測定結(jié)果顯示，Bp1805 對溫度有一定耐受性，在40 ℃～50 ℃范圍內(nèi)效價基本不變，較為穩(wěn)定，50 ℃～80 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加其效價下降很快，80 ℃降為零(圖1A)。表明，Bp1805 最適溫度為50 ℃以下。

最適pH 值測定結(jié)果顯示，Bp1805 對pH 的適應(yīng)范圍較廣，在pH5～pH10 仍能保持較高活性，效價在108以上；pH 在5 以下或10 以上，Bp1805 的活性開始下降(圖1B)。Bp1805 最適pH 為6～8，效價在1010以上。

最佳MOI 測定結(jié)果顯示，當(dāng)MOI 1 時，Bp1805侵染大腸桿菌并裂解出子代噬菌體效價最高，達(dá)到2.35×1010pfu/mL，其MOI 為1。一步生長曲線測定結(jié)果見圖1C，Bp1805 的潛伏期為20 min，裂解期為50 min。之后，噬菌體效價穩(wěn)定在1.48×1010pfu/mL左右。

圖1 噬菌體Bp1805 生物學(xué)特性測定結(jié)果Fig.1 Biological characteristics of phage Bp1805

2.3 大腸桿菌病的噬菌體治療效果 口服和腹腔注射Bp1805 治療大腸桿菌感染試驗，結(jié)果顯示，該噬菌體對雞大腸桿菌病具有一定的治療作用，抗生素治療組致病指數(shù)分別為56.3 %和62.5 %，治療效果較差(表1)。表明，Bp1805 對致病性大腸桿菌有很好的治療作用，腹腔注射噬菌體效果優(yōu)于口服方式，在大腸桿菌感染前注射噬菌體起到很好的預(yù)防作用，感染后的6 h 內(nèi)起到一定的治療作用?？股亟M致病指數(shù)高于噬菌體，可能與試驗致病性大腸桿菌攜帶的耐藥性有關(guān)。Bp1805 治療大腸桿菌的治療效果明顯優(yōu)于抗生素組?？瞻捉M雞的疾病計分和致病指數(shù)均為0。

噬菌體具有對細(xì)菌特異、高效、快速殺傷的特性，特定的噬菌體只感染裂解特定的目標(biāo)菌株[2,5]。噬菌體殺傷細(xì)菌能力強，在細(xì)菌體內(nèi)大量復(fù)制增殖，但對人和動物是安全的[4,6]。能否分離鑒定多種噬菌體組成復(fù)合噬菌體制劑來防治細(xì)菌性疾病，甚至是防治多種細(xì)菌的混合感染，在養(yǎng)殖業(yè)將有很大的應(yīng)用前景。噬菌體治療試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌噬菌體治療效果與給藥方式、給藥時間有關(guān)。盡管噬菌體治療細(xì)菌感染效果明顯，但仍需解決如何延長噬菌體的保存時間、保存活性、準(zhǔn)確把握給藥時間、給藥途徑、提高給藥的效率及安全性、科學(xué)評價噬菌體的治療效果等難題[7-8]。

表1 致病指數(shù)Table 1 Intravenous pathogenicity index