王洪彬，朱利霞，高桂生，史秋梅

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島066600)

雞桿菌屬細(xì)菌是革蘭氏陰性桿菌，由輸卵管雞桿菌、鴨源雞桿菌、海藻糖發(fā)酵雞桿菌、虎皮鸚鵡雞桿菌及3 個(gè)復(fù)合群組成[1-3]。雞桿菌病是近幾年來國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)菌性傳染病，其病原菌雞桿菌是一種條件性致病菌，具有廣泛的感染譜，其中雞是最常見的感染宿主，不同品種、日齡雞均可感染發(fā)病，主要引起心包炎、敗血癥、肝炎、呼吸道疾病等[4]。近年來，由該菌屬細(xì)菌引起的細(xì)菌性疾病呈逐年增加趨勢[5-7]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從送至河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的病死賽鴿心臟、脾臟、肺臟、肝臟等組織樣品中分離得到病原菌，對其進(jìn)行動(dòng)物致病性試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn)，為賽鴿養(yǎng)殖中由雞桿菌復(fù)合群-3 引起的細(xì)菌性疾病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2018 年8 月份，遼寧省某賽鴿場養(yǎng)殖人員將病死賽鴿送到河北科技師范學(xué)院-河北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，發(fā)病賽鴿主要臨床表現(xiàn)為怠倦不飛、厭食消瘦等。10 只健康種鴿購自秦皇島某養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DL2000 plus DNA Marker、dNTP、EXTaqDNA 聚合酶購自天根生化科技(北京)有限公司；血平板購自鄭州安圖生物工程有限公司；Gel extraction kit(100)購自O(shè)mega公司；常規(guī)藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；pMD18-T 載體、DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)ID32E 鑒定試紙條購自法國梅里埃公司。

1.3 病原菌的分離純化 無菌采集病死賽鴿心臟、脾臟、肺臟、肝臟等組織樣品，用無菌接種環(huán)接種于TSA 平板上，于37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取優(yōu)勢菌株的單菌落于血平板劃線純培養(yǎng)，并經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢觀察。

1.4 病原菌的生化鑒定 利用ID32E 生化鑒定試紙條進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定，由ATB 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)判定結(jié)果。

1.5 分離菌株的16S rDNA 鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA；利用16S rDNA 通用引物對分離菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[8]；回收陽性產(chǎn)物并克隆于pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化至DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；利用藍(lán)白斑篩選出白色菌落，并經(jīng)PCR 檢測陽性的菌液由北京生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

將測序所得的序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中相關(guān)病原16S rDNA 基因序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其同源性。

1.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn) 將病原菌單菌落接種于TSB 中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，并計(jì)數(shù)；以無菌PBS 稀釋至終濃度為1.0×109cfu/mL，隨機(jī)選取5 只健康種鴿作為實(shí)驗(yàn)組，種鴿通過氣管注射[1]上述菌懸液0.2 mL/只；剩余5 只種鴿作為對照組，注射無菌生理鹽水0.2 mL/只。對照組和實(shí)驗(yàn)組隔離飼喂，觀察種鴿的臨床表現(xiàn)。對病死種鴿及時(shí)剖檢，觀察病理變化，分離鑒定病原菌。

按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B 紙片擴(kuò)散法對分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離菌株的形態(tài)特征 對病死賽鴿心臟、脾臟、肺臟、肝臟等組織樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果從心臟、脾臟、肺臟、肝臟等組織樣品中均分離純化得到1 株形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌株；在TSA 平板上長出乳白色、邊緣整齊、凸起、不透明菌落；在血平板長出光滑、圓形、凸起、不溶血菌落；革蘭氏染色結(jié)果顯示，分離菌株為革蘭陰性短桿菌，菌體兩端鈍圓，多呈單個(gè)或成對排列，命名為HLD-1。查閱文獻(xiàn)，分離菌株HLD-1 的形態(tài)特征與雞桿菌復(fù)合群-3 的形態(tài)特征一致。

2.2 分離菌株的生化鑒定 對分離菌株HLD-1 進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果顯示，分離菌株HLD-1 具有脂酶、L-天冬氨酸芳胺酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳酸苷酶、鳥氨酸脫羧酶活性，無精氨酸雙水解酶、β-葡萄糖苷酶、賴氨酸脫羧酶、α-葡萄糖苷酶、尿素酶活性；吲哚反應(yīng)和酚紅反應(yīng)均為陽性；不能發(fā)酵α-麥芽糖；丙二酸鹽反應(yīng)和肌醇反應(yīng)為陰性。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》 比對顯示，分離菌株HLD-1 生化特性與雞桿菌復(fù)合群-3的生化特性相符。

2.3 分離菌株的16S rDNA 鑒定 以分離菌株HLD-1 的基因組DNA 為模板，進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段約為1 500 bp，與預(yù)期大小相符(圖1)；測序結(jié)果與雞桿菌復(fù)合群-3 基因序列一致，表明分離菌為雞桿菌復(fù)合群-3。

將測序得到的16S rDNA 基因序列經(jīng)Blast 比對分析，結(jié)果顯示分離菌株HLD-1 的16S rDNA 基因序列與GenBank 中雞桿菌復(fù)合群-3 相應(yīng)序列同源性為99.7 %。對分離菌株HLD-1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，分離菌株HLD-1 與輸卵管炎雞桿菌(Gallibac-terium salpingitidis)、海藻糖發(fā)酵雞桿菌(Gallibacterium trehalosifermentans)、虎皮鸚鵡雞桿菌(Gallibacterium melopsittaci)、鴨源雞桿菌(Gallibacterium anatis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)位于不同的進(jìn)化分支中，而與雞桿菌復(fù)合群-3(Gallibacterium genomosp.3)聚為一支(圖2)，進(jìn)一步證實(shí)了分離菌株HLD-1 為雞桿菌復(fù)合群-3，且該菌株與歐洲株(EU339201.1)的親緣關(guān)系最近，這與董文龍等[1]報(bào)道一致。

圖1 分離菌株HLD-1 的16S rDNA 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 Amplification for 16S rDNA gene of HLD-1 isolate by PCR

圖2 分離菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the 16S rDNA gene of HLD-1 isolate and related strains

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將分離菌株采用氣管注射的方法對種鴿進(jìn)行致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，種鴿在接種24 h 后，陸續(xù)發(fā)病，主要表現(xiàn)為精神萎靡、羽毛凌亂、食欲下降等；接種3 d 后陸續(xù)死亡，剖檢死亡種鴿可見氣管內(nèi)含有大量黏液且有出血現(xiàn)象，肺臟出血，肝臟腫大，個(gè)別種鴿腸道有少量出血點(diǎn)，與送檢死亡賽鴿病變一致。無菌采集死亡種鴿心臟、脾臟、肺臟、肝臟等組織樣品，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。結(jié)果顯示，分離菌與接種的菌株菌落形態(tài)特征、生化鑒定特征、16S rDNA 基因序列一致。對照組種鴿活動(dòng)無任何異常。表明，此次分離到的雞桿菌復(fù)合群-3 對種鴿具有一定的致病性。

雞桿菌復(fù)合群-3 最早發(fā)現(xiàn)于歐洲國家；在國內(nèi)，楊曉林等報(bào)道從四川某種鴿場的種鴿肺臟、肝臟、輸卵管等樣品組織中分離到該菌，病鴿主要臨床癥狀為呼吸困難、氣管出血、肺出血、輸卵管炎等[9]；董文龍等報(bào)道從吉林省某信鴿繁育場病死信鴿氣管中分離到雞桿菌復(fù)合群-3，且證實(shí)了該菌具有較強(qiáng)的致病性[1]，因此在獸醫(yī)臨床上不可忽視其對畜牧業(yè)的潛在威脅。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 本試驗(yàn)選用臨床常用12 種抗菌藥物對分離菌株HLD-1 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離菌株HLD-1 對β-內(nèi)酰胺類氨芐西林、頭孢曲松敏感；對其它抗生素不敏感(表1)。本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)病賽鴿經(jīng)頭孢曲松治療，其感染癥狀改善，很快痊愈，證實(shí)此次引起賽鴿發(fā)病死亡的病原菌是所分離的菌株，因此在遼寧地區(qū)的生產(chǎn)實(shí)踐中，建議賽鴿在發(fā)生雞桿菌復(fù)合群-3 感染時(shí)，優(yōu)先使用頭孢曲松、氨芐西林治療?？傊?，在賽鴿養(yǎng)殖過程中一旦感染細(xì)菌性疾病，需結(jié)合動(dòng)物機(jī)體實(shí)際情況，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理用藥。

表1 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Antimicrobial susceptibility testing of HLD-1 isolate