邢常瑞 章 鋮 楊 鍇 董 雪 鞠興榮 袁 建 何 榮

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京 210023)

大米蛋白及其功能性產(chǎn)品具有致敏性低、氨基羧含量高、比例合理等優(yōu)點(diǎn)，近年以來(lái)在嬰幼兒產(chǎn)品和高端產(chǎn)品領(lǐng)域具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。然而隨著中國(guó)工業(yè)化快速發(fā)展，部分省市以污染環(huán)境為代價(jià)導(dǎo)致土壤中重金屬污染嚴(yán)重。這些重金屬通過(guò)“天氣-河流-土壤-植物”的自然循環(huán)系統(tǒng)富集在植物中，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體從而引發(fā)一系列疾病，危害生命健康[1]，如日本富山縣“痛痛病”事件。鎘易于在腎臟中累積，進(jìn)而可能損害腎臟所處的泌尿系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為近端腎小管功能障礙[2]。重金屬鉛進(jìn)入人體后會(huì)溶于血液中，進(jìn)而阻礙血細(xì)胞的合成，導(dǎo)致貧血。長(zhǎng)此以往，會(huì)對(duì)人體的血液循環(huán)系統(tǒng)，消化系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生巨大危害。根據(jù)聯(lián)合國(guó)報(bào)道，在貧困地區(qū)的居民，長(zhǎng)期飲用被砷污染的地下水會(huì)造成多器官的細(xì)胞毒性，甚至是癌癥[3]。

水稻是較易富集重金屬的主糧之一，重金屬鎘、鉛、砷更易于與大米的蛋白質(zhì)結(jié)合?？讘c新[4]對(duì)受污染大米可能鎘分布部位的實(shí)驗(yàn)探究，得出鎘主要與米胚乳中的谷蛋白絡(luò)合而存在，是一類(lèi)金屬鎘與蛋白質(zhì)形成的絡(luò)合物。陳露等[5]采用Osborne分級(jí)法提取秈糙米(鎘含量215.31 μg/kg)中的4種蛋白質(zhì)(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白)，發(fā)現(xiàn)4種大米蛋白中的鎘含量分別為0.66、0.31、0.63、0.23 mg/kg，清蛋白中鎘含量最高。楊居榮[6]采用組織化學(xué)及溶劑提取法研究發(fā)現(xiàn)，Cd、Cu、Pb在稻谷和小麥籽實(shí)中優(yōu)勢(shì)形態(tài)是蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)，并且球蛋白和谷蛋白結(jié)合Cd的比例高。然而，到目前為止，鮮有報(bào)道分析砷與大米結(jié)合蛋白的特征和相關(guān)的理化性質(zhì)以及結(jié)合機(jī)理。

本實(shí)驗(yàn)選取砷污染較嚴(yán)重的大米為研究對(duì)象，通過(guò)Osborne法的原理連續(xù)提取各級(jí)蛋白質(zhì)，并結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、紫外掃描分析(UV)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)等方法對(duì)砷結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行性質(zhì)表征。利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)定量分析不同大米蛋白中重金屬含量，并結(jié)合氨基酸組成分析研究特征蛋白氨基酸組成，得出砷在稻米中的分布規(guī)律，為后續(xù)稻米砷消減技術(shù)和開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)米蛋白產(chǎn)品、響應(yīng)國(guó)家優(yōu)質(zhì)糧食工程建設(shè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

實(shí)驗(yàn)樣品為采集的砷污染嚴(yán)重的大米(粳稻、產(chǎn)自湖南某地、2017年秋)。取重金屬污染大米適量，用礱谷機(jī)將稻谷外殼去掉，保留糙米，然后用萬(wàn)能粉碎機(jī)將糙米磨成粉末，過(guò)60目篩得到糙米粉，待用。

1.2 試劑與儀器

石油醚、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、硝酸、過(guò)硫酸銨、Tris-HCl、過(guò)氧化氫、濃硝酸、溴化鉀、聚丙烯酰胺凝膠電泳相關(guān)試劑、ZipTip C4微量層析柱、SA基質(zhì)溶液。

JXFM110錘式旋風(fēng)磨；CEM MARSX微波消解萃取裝置；7700x電感耦合等離子質(zhì)譜儀；pHS-3C型精密數(shù)顯pH計(jì)；5800MALDI-TOF-MS基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；BLH-3250型實(shí)驗(yàn)礱谷機(jī)；JNMJ6型檢驗(yàn)?zāi)朊讬C(jī)；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；U-3900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Bio-Red 165-8001 小型垂直電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 大米中蛋白的提取與純化

根據(jù)4種蛋白(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白)溶解度的差異，分別以蒸餾水，5% NaCl溶液，70%乙醇溶液，0.05 mol/L NaOH溶液作為主要溶劑，采用Osborne法分步提取四種蛋白。每次室溫?cái)嚢杼崛r(shí)間2 h，固液比4∶1，通過(guò)離心(10 000 r/min，10 min)分離沉淀蛋白，每步重復(fù)提取3次。合并提取液并通過(guò)0.45 μmol/L過(guò)濾，通過(guò)滴加2 mol/L HCl調(diào)節(jié)等電點(diǎn)沉淀提取液中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行冷凍干燥，-20 ℃保存。具體提取步驟見(jiàn)圖1。

1.3.2 SDS-PAGE電泳

將分離得到的適量清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白，谷蛋白分別溶于蒸餾水，5%(m/V) NaCl溶液，70%(V/V)乙醇溶液，0.05 mol/L NaOH溶液制成0.3%(m/V)蛋白樣液。并分別吸取各蛋白樣液10 μL，加入上樣緩沖液30 μL于2.5 mL離心管中，沸水浴加熱3 min備用。配制10%(m/V)分離膠，5%(m/V)濃縮膠。連接電泳槽，裝入已制備好的凝膠，在電泳槽中加適量電泳緩沖液，依次緩慢滴加Marker，蛋白樣液各10 μL。凝膠電泳初始電壓設(shè)置為70 V，待條帶跑至黑線(xiàn)時(shí)，加大電壓至120 V。凝膠電泳結(jié)束后將凝膠小心取下，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中搖床振蕩40～60 min，后置于脫色液中搖床振蕩約180 min，最后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.3 MALDI-TOF-MS檢測(cè)

用ZipTip C4對(duì)蛋白樣品進(jìn)行脫鹽，在樣品靶上點(diǎn)樣1 μL蛋白樣品并風(fēng)干，加入0.6 μL SA基質(zhì)溶液點(diǎn)后風(fēng)干，在旁邊做標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)照。選取線(xiàn)性方法在正離子條件下進(jìn)行相關(guān)樣品的校準(zhǔn)測(cè)試，并用線(xiàn)性方法測(cè)試蛋白樣品的分子質(zhì)量。

1.3.4 紫外掃描分析

將適量清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白，谷蛋白分別溶于蒸餾水，5%(m/V) NaCl溶液，70%(V/V)乙醇溶液，0.05 mol/L NaOH溶液制成0.1%(m/V)蛋白樣液。分別以蒸餾水、5%(m/V) NaCl溶液、70%(V/V)乙醇溶液、0.05 mol/L NaOH溶液作為空白進(jìn)行基線(xiàn)校正，再對(duì)同溶劑的蛋白溶液在200-800 nm范圍內(nèi)的紫外吸收強(qiáng)度進(jìn)行掃描測(cè)試。

圖1 Osborne分級(jí)法提取糙米中的蛋白質(zhì)

1.3.5 傅里葉紅外光譜儀檢測(cè)

采用壓片法進(jìn)行傅里葉紅外光譜檢測(cè)，樣品與KBr的比例約為1:100于研缽中研磨均勻，并用壓片機(jī)進(jìn)行壓片。在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行掃描測(cè)量，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 砷含量檢測(cè)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3 g樣品于消解管中，并加入2 mL 30%(V/V)過(guò)氧化氫溶液以及5 mL 65%(V/V)濃硝酸，置于通風(fēng)櫥靜置40 min后，將消解管放入微波消解萃取裝置中消解60 min，待消解完畢后，放入電加熱器中設(shè)定160 ℃，進(jìn)行趕酸，趕酸結(jié)束后用2%稀硝酸將消解管中樣品定容至10 mL容量瓶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)試樣品中砷含量。

1.3.7 蛋白氨基酸組成分析

稱(chēng)取0.2 g樣品放入水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl后密封，于110 ℃的烘箱下水解24 h。將水解液用旋蒸儀進(jìn)行旋蒸以除去鹽酸，后加入0.02 mol/L HCl定容至50 mL，吸取少量水解液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，裝入進(jìn)樣瓶中，采用氨基酸分析儀中對(duì)各個(gè)蛋白進(jìn)行氨基酸組成分析。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用IBM SPSS 22.0進(jìn)行分析和處理，圖表用Origin Pro 2016繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE測(cè)試結(jié)果如圖2所示，用Osborne法分步提取4種蛋白中，醇溶蛋白有一條清晰的條帶，分子質(zhì)量在14.2 ku左右，表明醇溶蛋白是一個(gè)相對(duì)單一的組分；清蛋白有3個(gè)條帶，分子量分別在14.0、20.1、35～37 ku左右；球蛋白有2個(gè)條帶，分子質(zhì)量分別在18.5～19.5、37.0 ku左右。谷蛋白比較復(fù)雜，存在4個(gè)條帶，分子質(zhì)量分別在14.6、20～21、31、37.1～38.0 ku左右。該電泳結(jié)果與李亦蔚[7]提取和分離大米蛋白的研究結(jié)果較一致。說(shuō)明了此提取、分離、純化方法能制備出純度均一的各級(jí)大米蛋白。

圖2 SDS-PAGE測(cè)試結(jié)果

2.2 MALDI-TOF-MS分析

通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)測(cè)定分子質(zhì)量，結(jié)果如圖3所示。比較4種大米蛋白可知，醇溶蛋白只有一個(gè)較明顯的峰，分子質(zhì)量約為14.1 ku，這點(diǎn)與之前的電泳圖所得結(jié)果較一致，陳露在提取分離得到的鎘硫蛋白也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果[5]，這表明該醇溶蛋白是一類(lèi)低分子量的，純度單一的結(jié)合蛋白，其余蛋白的曲線(xiàn)圖譜與電泳圖譜基本一致，推測(cè)其余蛋白可能是多種不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，也有可能是含有多個(gè)亞基。

圖3 大米醇溶蛋白(a)、球蛋白(b)、清蛋白(c)和谷蛋白(D)的MALDI-TOF-MS測(cè)試結(jié)果

2.3 紫外掃描分析

以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。各蛋白紫外圖譜如圖4所示，從圖4可以看出，醇溶蛋白在257 nm處存在吸收峰，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)通常在250 nm處存在鎘硫蛋白特征吸收峰[8]，因此可以初步得到該類(lèi)蛋白是一種典型的金屬硫蛋白。清蛋白在242 nm左右處有強(qiáng)吸收峰，推測(cè)該處可能為該砷清蛋白特征吸收峰。

圖4 特征蛋白紫外圖譜

2.4 傅里葉紅外光譜儀分析

圖5 大米中醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白、球蛋白的FTIR圖

2.5 大米蛋白中重金屬分布規(guī)律研究

前期研究中發(fā)現(xiàn)隨著加工精度的增加，重金屬去除率也隨之增加。在碾米時(shí)間為120 s條件下，As總?cè)コ蔬_(dá)到42.57%，說(shuō)明砷在糙米外層含量很高，很可能以砷蛋白形態(tài)存在[11]。楊居榮等[12]研究發(fā)現(xiàn)出米率為68.6%的精米，與原稻谷相比鎘的去除率可達(dá)24.10%，這是由于稻米籽粒中約40%的鎘富集在占稻米總重9%的糊粉層中，而占稻米總重約71%的胚乳中僅富集了45%的鎘。因此本實(shí)驗(yàn)選用去殼的糙米作為原料，制備米粉，來(lái)研究大米蛋白質(zhì)中砷的分布具有現(xiàn)實(shí)意義。

首先測(cè)定砷污染稻谷的重金屬含量并對(duì)分離得到的四種大米蛋白進(jìn)行重金屬含量分析如表1所示，結(jié)果表明：污染大米中砷含量為0.242 mg/kg。通過(guò)分離得到的清蛋白中砷含量最高達(dá)到2.190 mg/kg，其次谷蛋白砷含量達(dá)到0.489 mg/kg，球蛋白和醇溶蛋白砷含量分別為0.110、0.076 mg/kg。砷與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，由此推斷其結(jié)合強(qiáng)度依次為：清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。根據(jù)提取所得的四種蛋白質(zhì)量以及對(duì)應(yīng)的蛋白重金屬含量，對(duì)比原始樣品的質(zhì)量和重金屬含量(蛋白質(zhì)量未給出)，計(jì)算得到四種蛋白砷含量占砷污染樣品中的63.17%，清蛋白的砷含量占總樣品的26.03%，表明砷污染大米中砷與清蛋白的結(jié)合態(tài)為優(yōu)勢(shì)形態(tài)。

表1 大米及大米蛋白砷含量

2.6 氨基酸組成分析

表2分析了4種蛋白之間氨基酸含量的差異，以及砷結(jié)合蛋白后蛋白氨基酸含量的變化。由于無(wú)砷污染大米的球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，與砷結(jié)合的球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白之間的氨基酸含量差異較小(該部分?jǐn)?shù)據(jù)未給出)，因此選用無(wú)砷污染大米的清蛋白與砷結(jié)合清蛋白進(jìn)行比較和分析砷對(duì)蛋白氨基酸含量的影響。

表2 蛋白樣品氨基酸組成

比較表3中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，幾種蛋白樣品的脯氨酸、谷氨酸的含量整體較高，半胱氨酸的含量整體較低。值得注意的是砷結(jié)合醇溶蛋白中脯氨酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于砷谷蛋白，兩者相差29.21%；而砷結(jié)合谷蛋白中谷氨酸含量高達(dá)19.39%明顯高于其他樣品，該結(jié)果與劉珊珊[13]研究鎘結(jié)合蛋白所發(fā)現(xiàn)的規(guī)律較一致。另外比較各種大米蛋白，發(fā)現(xiàn)砷結(jié)合蛋白中疏水性氨基酸含量較高，推測(cè)砷可能通過(guò)與疏水性氨基酸中的特征基團(tuán)結(jié)合的方式形成砷結(jié)合蛋白。

砷結(jié)合清蛋白與無(wú)砷污染的大米清蛋白相比，重金屬砷的存在提高了大米中天冬氨酸的含量，并降低了賴(lài)氨酸含量，該規(guī)律與王凱榮[14]等人鎘污染對(duì)稻米品質(zhì)的影響中所發(fā)現(xiàn)的規(guī)律較為一致。并且砷結(jié)合清蛋白與無(wú)污染的大米清蛋白相比，脯氨酸含量提高了10.14%，推測(cè)在砷結(jié)合清蛋白中，金屬砷可能通過(guò)脯氨酸與蛋白質(zhì)結(jié)合。

3 結(jié)論

本研究對(duì)砷污染的大米進(jìn)行連續(xù)提取，分離得到大米醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白和谷蛋白。通過(guò)SDS-PAGE、MAlDI-TOF-MS、紫外光譜以及傅里葉紅外光譜等方法對(duì)四種蛋白表征后，發(fā)現(xiàn)砷與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，砷與蛋白質(zhì)結(jié)合的強(qiáng)度依次為：清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。通過(guò)ICP-MS與氨基酸組成分析獲取了砷在四種蛋白質(zhì)中的分布規(guī)律：四種蛋白砷含量占砷污染樣品中的63.17%，清蛋白的砷含量占總樣品的26.03%，由此推測(cè)砷與清蛋白是優(yōu)勢(shì)的結(jié)合態(tài)；砷結(jié)合蛋白中脯氨酸含量明顯高于其他樣品，由此推測(cè)砷主要與蛋白中的脯氨酸進(jìn)行結(jié)合。