黃 茜 王淑慧 崔 婧 毛苗苗 徐 健 胡詩慧 慕鴻雁

(青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，青島 266000)

隨著生活水平的提高，人們對于功能性多不飽和脂肪酸的關注度大大提高，其中富含DHA的魚油、藻油是市場關注熱點。DHA是人體大腦和視網(wǎng)膜的重要組成部分，對嬰幼兒的智力和視力發(fā)育具有重要作用[1]；在炎癥控制、心血管疾病的調(diào)控、機體免疫力增強等方面發(fā)揮積極的功效[2-4]。市面上的DHA產(chǎn)品多來自于魚油，魚油中脂肪酸組成復雜，DHA含量相對不高，且其應用因海水污染、過度捕撈而受限。天然微藻是海生魚的食物，脂肪酸組成較簡單，是魚油中多不飽和脂肪酸的主要來源。我國國家衛(wèi)生部于2010年將裂壺藻油列為新資源食品，其DHA質(zhì)量分數(shù)約為40%，可添加于嬰幼兒配方奶粉，亦可作為多不飽和脂肪酸營養(yǎng)補充劑。但藻油含有大量C=C雙鍵，導致其性質(zhì)不穩(wěn)定，極易發(fā)生氧化酸敗，影響感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值降低，甚至產(chǎn)生對人體健康有潛在危害組分。因此，提出切實可行的提高藻油氧化穩(wěn)定性的解決方案，尤為必要。脂質(zhì)體是由磷脂等雙親性物質(zhì)組成的雙分子層閉合囊泡，可實現(xiàn)對功能性成分的包封和運載，有效發(fā)揮其緩控釋作用[5]；此外磷脂雙分子層的保護作用，還可有效提高功能成分的穩(wěn)定性[6]。研究表明以脂質(zhì)體形式存在的魚油氧化穩(wěn)定性顯著提高，將其作為食品基料添加于食品，具有較高的儲存穩(wěn)定性[7-8]，但是關于藻油脂質(zhì)體的制備及應用研究還很少?；谝陨详U述，本研究以大豆卵磷脂、膽固醇、DHA藻油、吐溫-80為原料，采用薄膜超聲法制備DHA藻油脂質(zhì)體，通過單因素試驗，以包封率、平均粒徑為指標探討最佳制備條件，通過紅外吸收光譜分析研究其氧化穩(wěn)定性，并對其體外消化進行模擬，以期為功能性多不飽和脂肪酸的穩(wěn)定化技術提供借鑒，也為藻油的應用研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

DHA藻油，大豆卵磷脂(純度≥97%)，膽固醇(≥95%)，豬胰脂酶，牛血清蛋白，膽酸鈉，吐溫-80；無水乙醇、石油醚、脲素、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810DASPC紫外可見光光度計；ZEN-3690Malvern納米激光粒度分析儀；SCIENTZ-10N冷凍干燥機；Neofuge15高速離心機；NICOLET iS10傅里葉變換紅外光譜儀；JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂質(zhì)體的制備[9]

采用薄膜分散法，稱取一定量的大豆卵磷脂、膽固醇、DHA藻油和吐溫-80，按一定比例加入無水乙醇中超聲混勻，于一定溫度旋轉蒸發(fā)脫溶并均勻成膜；再加入定量磷酸鹽PBS緩沖液，經(jīng)水化洗膜得到粗脂質(zhì)體，將其置于冰水浴中超聲一定時間得到均勻分散的脂質(zhì)體澄清液。

1.3.2 單因素實驗

分別考察原料配比(大豆卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比、大豆卵磷脂/DHA藻油質(zhì)量比)、制備因素(蒸脫溫度、pH、超聲時間和超聲功率)對DHA藻油脂質(zhì)體包封率及性質(zhì)的影響。

1.3.3 包封率的測定1.3.3.1 標準曲線繪制

(1)DHA藻油溶解于石油醚中，配成濃度為0.6 mg/mL的溶液，以石油醚為空白對照，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描，得到溶液的吸收波長掃描曲線；將大豆卵磷脂和膽固醇做相同處理。

(2)配制一系列不同濃度(0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL)的DHA藻油-石油醚溶液，以石油醚為空白，在最佳波長處測定DHA藻油-石油醚溶液的吸光度，以DHA藻油的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3.2 包封率

取適量DHA藻油脂質(zhì)體溶液于4 200 g離心10 min，得到上清液，取4 mL上清加入20 mL石油醚提取，靜置，然后在最佳波長處測定其吸光度，根據(jù)如下公式計算包封率：

包封率(EE)=(混懸液中油的總重量-未包封的油)/總的藻油重量×100%

1.3.4 粒徑、電位

取適量DHA藻油脂質(zhì)體，加入蒸餾水稀釋到合適濃度，采用納米激光粒度分析儀測定其平均粒徑大小和Zeta電位，平行測定3次并取平均值。

1.3.5 微觀形貌

將藻油脂質(zhì)體樣品加水稀釋至10 mg/mL，將銅網(wǎng)浸入樣品溶液，濾紙吸干多余液體，冷凍干燥，在透射電鏡下觀察藻油納米脂質(zhì)體的形態(tài)。

1.3.6 紅外吸收光譜

將凍干后的藻油脂質(zhì)體以無水乙醇復溶，取適量純溴化鉀粉末在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓制成空白KBr片，取一滴樣品溶液滴于空白KBr片上，在紅外燈下烘干后上機測定。

1.3.7 體外模擬消化[9]

腸液消化液(pH 7.4)：取9.07 g KH2PO4，0.007 5 g脲素，1 g牛血清蛋白，0.375 g豬胰脂酶，1.5 g膽酸鈉用0.2 N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4[9]。

消化反應：將脂質(zhì)體樣品與模擬腸液溶液以1∶3的體積比混合，在37 ℃水浴恒溫振蕩器中混勻預熱。豬胰脂酶以相應的腸液溶解，反應開始時間為加入酶的瞬間。在1、5、20、120 min時分別取樣于95 ℃的恒溫水浴鍋中加熱2 min滅酶，測定其平均粒徑。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

DHA藻油、大豆卵磷脂、膽固醇石油醚溶液的吸收波長如圖1所示，藻油的最大吸收峰出現(xiàn)在240 nm處，大豆卵磷脂和膽固醇最大吸收峰也出現(xiàn)在此處，而藻油在274 nm處有一個突出的吸收峰。因此，將274 nm選作測定藻油脂質(zhì)體包封率的最佳吸收波長。根據(jù)在274 nm波長處所測得的數(shù)據(jù)，以藻油-石油醚溶液濃度為橫坐標吸光度為縱坐標，得到藻油-石油醚溶液標準曲線，如圖2所示，其線性回歸方程為y=0.611 9x+0.008 6，R2=0.999 3。

圖1 DHA藻油、大豆卵磷脂、膽固醇石油醚溶液的吸收波長

圖2 DHA藻油-石油醚溶液標準曲線

2.2 單因素結果分析

2.2.1 原料配比對DHA藻油脂質(zhì)體包封率和性質(zhì)的影響

以脂質(zhì)體的包封率、粒徑和電位為考察指標，在其他因素(溫度40 ℃、pH 7.2、超聲功率350 W、超聲時間60 s)不變情況下分別探討了大豆卵磷脂/DHA藻油質(zhì)量比、卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率及性質(zhì)的影響，結果如圖3、圖4所示。

圖3 物料比對脂質(zhì)體包封率的影響

a

b圖4 物料比對脂質(zhì)體粒徑、電位、PDI的影響

由圖3可知，隨著大豆卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比的提高，DHA藻油脂質(zhì)體的包封率逐漸增加，在兩者質(zhì)量比為3∶1時最大，之后呈降低趨勢。這是由于膽固醇會改變大豆卵磷脂的相變溫度，影響磷脂雙分子層的流動性。適量的膽固醇會降低磷脂雙分子層的流動性，使脂質(zhì)體膜的致密性增加，從而提高包埋率[10]。保持大豆卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比為3∶1，考察大豆卵磷脂與DHA藻油質(zhì)量比對脂質(zhì)體包封率的影響，發(fā)現(xiàn)包封率變化顯著。當大豆卵磷脂/DHA藻油質(zhì)量比為2∶1時，脂質(zhì)體包封率僅為(70.05±0.54)%；隨著卵磷脂比例升高，包封率逐漸增加，當卵磷脂/DHA藻油比為5∶1時，包封率達到(88.46±0.87)%，之后繼續(xù)增加卵磷脂含量，包封率變化不明顯。在整個原料配比考查范圍內(nèi)，脂質(zhì)體粒徑為200～600 nm，說明所制備的脂質(zhì)體為納米脂質(zhì)體。電位是考察脂質(zhì)體顆粒穩(wěn)定性的重要參考指標，顆粒間靜電斥力越大，脂質(zhì)體顆粒越不容易發(fā)生聚集等現(xiàn)象[11]。在整個物料比考察范圍內(nèi)，所得脂質(zhì)體的電位絕對值均高于30 mV，說明該條件下所制備的脂質(zhì)體具有較好的穩(wěn)定性。當卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比為3∶1，卵磷脂/DHA藻油質(zhì)量比為5∶1時，所制備的納米脂質(zhì)體粒徑為(247.1±0.3)nm， PDI為0.279±0.003，說明脂質(zhì)體粒徑分布均勻。故確定大豆卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比為3∶1、大豆卵磷脂/藻油質(zhì)量比為5∶1。

2.2.2 制備因素對藻油脂質(zhì)體包封率和性質(zhì)的影響

保持大豆卵磷脂/膽固醇質(zhì)量比為3∶1，卵磷脂/藻油質(zhì)量比為5∶1，分別探討了蒸脫溫度、pH、超聲時間和超聲功率對納米脂質(zhì)體包封率和粒徑、PDI、電位的變化，結果如圖5、圖6。

圖5 制備條件對脂質(zhì)體包封率的影響

由圖5可知，溫度、pH和超聲功率對脂質(zhì)體包封率具有重要的影響，在實驗溫度范圍內(nèi)，脂質(zhì)體的包封率先增加后降低，實驗過程中發(fā)現(xiàn)溫度過低會導致脂質(zhì)體成膜時間長且不均勻，溫度過高則會增加DHA藻油的氧化損失。蒸脫溫度為40 ℃時，脂質(zhì)體的包封率最高。脂質(zhì)體的外被膜為磷脂雙分子層，因此酸性條件下會加速脂質(zhì)體的水解[10]，在實驗范圍內(nèi)，脂質(zhì)體的包封率隨著pH增加而增加，當溶液pH為7.4時，脂質(zhì)體包封率相比于其他pH值脂質(zhì)體包封率較高。適度的超聲有利于脂質(zhì)體的分散，而長時間超聲，可影響脂質(zhì)體囊泡的結構，且超聲會產(chǎn)生熱量，時間越長，產(chǎn)生的熱量越多，會影響到磷脂雙分子層的穩(wěn)定性，當超聲時間為120 s時脂質(zhì)體的包封率最高。DHA藻油脂質(zhì)體的包封率隨著超聲功率的增加呈現(xiàn)先增大后減小的變化，這是由于過高的超聲功率會破壞脂質(zhì)體囊泡結構，使DHA藻油從脂質(zhì)體中滲漏，從而使包封率降低，當超聲功率為350 W時，包封率顯著高于其他功率下的結果。

圖6 制備條件對脂質(zhì)體粒徑、PDI和電位的影響

圖6是各制備條件下脂質(zhì)體的粒徑、電位及PDI。由圖6可知，各制備因素對所得脂質(zhì)體的粒徑、PDI和電位均有重要的影響，但在實驗范圍內(nèi)，所制得的脂質(zhì)體粒徑均小于600 nm，電位絕對值為25～48 mV。當蒸脫溫度為40 ℃、pH7.4、350 W超聲120 s時所制備的脂質(zhì)體包封率最高，為(91.55±0.4)%，粒徑為(224.5±0.21)nm，PDI為0.224±0.003，電位(-32.4±0.03)mV，說明所制備的納米脂質(zhì)體粒徑分布均勻且穩(wěn)定。

所得藻油脂質(zhì)體的最佳制備條件為：大豆卵磷脂與膽固醇比為3∶1(g/g)、大豆卵磷脂與DHA藻油比為5∶1(g/g)、蒸脫溫度為40 ℃、pH為7.4、超聲時間為120 s、超聲功率為350 W。

2.2.3 透射電鏡結果分析

DHA藻油脂質(zhì)體的透射電鏡圖如圖7所示。由圖7可見，脂質(zhì)體呈現(xiàn)球形或橢圓形，粒徑均在納米級，這與激光粒度分析儀所測得的結果一致；最佳條件下的脂質(zhì)體邊緣基本沒有油脂，說明最佳條件下脂質(zhì)體對DHA藻油的包封效果明顯。

圖7 藻油脂質(zhì)體的透射電鏡圖

2.2.4 紅外吸收光譜分析

注：圖中曲線從上到下依次為脂質(zhì)體，DHA藻油，膽固醇，卵磷脂。a

注：圖中曲線從上到下依次為室溫放置1周的DHA藻油，DHA藻油，室溫放置1周的脂質(zhì)體，脂質(zhì)體。b圖8 大豆卵磷脂、膽固醇、DHA藻油、脂質(zhì)體的紅外光譜

2.2.5 體外模擬消化結果分析

研究表明，脂質(zhì)在體內(nèi)的消化與脂肪酶的活性有關，而低pH對脂質(zhì)體的影響很小[13]。本實驗在預實驗中也得到了一致的結果。由于脂肪酶、磷脂酶主要分布在小腸中，本研究重點探究了脂質(zhì)體在腸液中的粒徑的變化，結果如圖9所示。

藻油脂質(zhì)體在模擬腸液溶液中平均粒徑呈先逐漸增加而后減小的趨勢。本實驗中所用的胰脂酶是從豬體內(nèi)提取得到的，含有脂解酶(包括脂肪酶、磷脂酶A2和膽固醇酶)，這三種脂解酶均對磷脂產(chǎn)生作用，其中，磷脂酶A2對磷脂雙分子層結構具有較強的破壞能力。經(jīng)脂解酶的作用，DHA藻油脂質(zhì)體的結構可能發(fā)生變化，導致脂質(zhì)體的絮凝，從而使平均粒徑增大。隨著脂質(zhì)體被消化，其平均粒徑隨之減小，這是由于腸液中膽酸鈉的存在，破壞了脂質(zhì)體的雙分子層膜，脂質(zhì)體被消化吸收，使平均粒徑減小[14]。

圖9 不同消化時間脂質(zhì)體的粒徑

3 結論

本研究以包封率、平均粒徑為指標，通過單因素試驗確定了制備DHA藻油脂質(zhì)體的最佳條件:大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為3∶1(g/g)、大豆卵磷脂與DHA藻油質(zhì)量比為5∶1(g/g)、溫度為40 ℃、pH為7.4、超聲時間為120 s、超聲功率為350 W。在此條件下，脂質(zhì)體包封率可達(91.55±0.4)%，粒徑為(224.5±0.21)nm，PDI為0.224±0.003，電位(-32.4±0.03) mV，形貌為橢圓球形。通過紅外吸收光譜圖發(fā)現(xiàn)，DHA藻油脂質(zhì)體對DHA藻油的包封效果良好，室溫放置數(shù)天后的DHA藻油脂質(zhì)體紅外光譜圖無明顯變化，DHA藻油脂質(zhì)體的穩(wěn)定性遠高于DHA藻油。