邵小龍 徐水紅 徐 文

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

保障儲(chǔ)糧品質(zhì)對于維護(hù)國家糧食安全具有十分重大的意義。據(jù)相關(guān)資料顯示，我國特別是農(nóng)戶的儲(chǔ)糧損失約為6%～9%[1]，其中儲(chǔ)糧害蟲的危害性最大。儲(chǔ)糧害蟲主要分為糧粒內(nèi)部害蟲(隱蔽性害蟲)和糧粒外部害蟲，隱蔽性害蟲整個(gè)生長過程都在糧粒內(nèi)部完成，肉眼無法察覺，對糧食的危害最為嚴(yán)重。玉米象是一種最常見的糧食隱蔽性害蟲，能引起糧食品質(zhì)及數(shù)量的損失[2]。因此實(shí)現(xiàn)玉米象的早期檢出對于提高我國儲(chǔ)糧品質(zhì)顯得尤為重要。

軟X射線作為一種快速無損的儲(chǔ)糧害蟲檢測技術(shù)，具有悠久的發(fā)展歷史[3,4]。圖像像素值的大小反映了X射線穿透被檢測物的衰減度，當(dāng)糧粒受到害蟲感染時(shí)密度發(fā)生改變引起X射線透射率的變化，故與正常糧粒相比X成像圖片有所不同。Karunakaran等[5]研究表明軟X射線可以準(zhǔn)確判別超過95%的未感染小麥以及受不同階段米象感染的小麥。Nawrocka等[6]使用軟X射線成像測定被谷象侵染的小麥籽粒質(zhì)量損失，根據(jù)質(zhì)量損失的差異來確定谷象的不同蟲態(tài)。單一的軟X射線檢測方法對于隱蔽性害蟲的早期檢出存在一定局限，Chelladurai等[7]將軟X射線與近紅外高光譜兩者聯(lián)用，大大提高了四紋豆象卵期以及早期幼蟲的檢測準(zhǔn)確率。

低場核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance，簡寫LF-NMR)是近些年發(fā)展起來的一種分析檢測技術(shù)，在牛奶[8]、食用油[9～11]、肉制品[12,13]等異物或摻假檢測方面表現(xiàn)出很好的檢測效果，低場核磁能對氫質(zhì)子(特別是水)快速準(zhǔn)確檢測，害蟲侵入糧粒內(nèi)部屬于外來物，由于昆蟲個(gè)體含水率與糧粒差別很大[14]，因此低場核磁有可能作為檢測外來害蟲的方法。

本研究通過軟X射線拍攝的圖片，觀察玉米象在小麥內(nèi)部的整個(gè)生長發(fā)育周期，提取未感染以及被不同階段玉米象感染小麥的紋理特征，利用LDA與QDA分類模型判斷不同分類情況下的判別準(zhǔn)確率。將低場核磁引入儲(chǔ)糧害蟲檢測領(lǐng)域，與高清軟X射線拍攝圖片相結(jié)合，測定玉米象在小麥體內(nèi)的生長發(fā)育情況，根據(jù)玉米象與小麥特征峰值比例的變化，判斷小麥?zhǔn)欠袷艿接衩紫蟾腥静⑶姨幱谀姆N蟲態(tài)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

試驗(yàn)樣品小麥為硬質(zhì)紅小麥，來自于南京市石埠橋糧食儲(chǔ)備庫，未試驗(yàn)前均放在4 ℃冰箱中儲(chǔ)藏,為防止小麥中可能含有蟲卵，實(shí)驗(yàn)前在80 ℃烘箱中烘2 h進(jìn)行殺蟲處理。試驗(yàn)樣蟲玉米象來源于糧食儲(chǔ)運(yùn)國家工程實(shí)驗(yàn)室(南京)培養(yǎng)的多代種群，置于溫度(29±1)℃、相對濕度(65±2)%條件下生長繁殖。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

ZXFLASEE U微焦點(diǎn)X光檢測儀；NMI20-Analyst型核磁共振分析儀；1001-1 型電熱鼓風(fēng)干燥箱；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱；JE1001型電子天平(精度為0.01 g)萬能粉碎機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備以及X射線圖像獲取

采用烘箱法調(diào)節(jié)小麥含水量12%左右，挑選約100 g小麥放入500頭玉米象成蟲置于溫度(29±1)℃、相對濕度(65±2)%條件下生長繁殖48 h后移出所有成蟲。共挑選252粒感染與未感染小麥，置于自制裝樣多孔板上每2天進(jìn)行X射線圖像采集，記錄玉米象從卵、幼蟲、蛹，成蟲以及羽化而出的整個(gè)生長發(fā)育過程。

本研究中使用的軟X射線成像系統(tǒng)(丹東中訊科技有限公司)包含實(shí)時(shí)圖像采集，圖像和視頻保存，幾何尺寸測量等。將小麥籽粒手動(dòng)放置在樣品臺(tái)的自制多孔板上，并在30 kV電位和100 μA電流下進(jìn)行X射線照射采集，直到多孔板上所有的籽粒成像完成。X射線儀的其他參數(shù)設(shè)置如下：窗寬3 275，窗位5 578，亮度0，對比度2。小麥籽粒的X射線圖像以64像素mm-1的分辨率被數(shù)字化為8位灰度圖像。

1.3.2 圖像特征值的提取

紋理特征用于量化小麥籽?；叶葟?qiáng)度的空間分布。利用灰度共生矩陣和灰度游程矩陣共提取了小麥灰度圖像的30個(gè)紋理特征[15～17]?；叶裙采仃嚪从沉藞D像灰度分布的方向、幅度和局部區(qū)域的綜合信息，并且使用MATLAB程序提取了24個(gè)特征：在0°，45°，90°和135°處四個(gè)方向的四個(gè)GLCM特征(能量，熵，對比度，相關(guān)性)，四個(gè)平均值和四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差[17]?；叶扔纬叹仃嚧碓趯ο笾谐霈F(xiàn)相同或相似灰度級的共線和連續(xù)像素，并且使用MATLAB程序提取了6個(gè)特征：短程，長程，灰度不均勻性，運(yùn)行百分比 ，運(yùn)行長度不均勻，低灰度運(yùn)行[17]。

1.3.3 分類判別

分類方法參照Chelladurai 等[7]。選擇線性判別分析(LDA)和二次判別分析(QDA)作為分類判別模型, 用SAS9.4的DISCRIM程序采用差一法對未感染與不同感染階段的小麥進(jìn)行分類。通過X射線拍攝的圖片，每個(gè)感染階段挑選70粒樣品進(jìn)行分類判別。LDA和QDA模型的三種不同交叉驗(yàn)證如下：1)五類(未感染小麥、卵期、幼蟲、蛹期以及蛀空糧粒); 2)三類(未感染小麥、卵期到成蟲視為感染階段以及蛀空糧粒);3)二類(未感染小麥與不同感染階段)。

1.3.4 橫向弛豫參數(shù)測定

實(shí)驗(yàn)前，通過核磁共振波譜分析軟件中的FID(free induction decay)脈沖序列校準(zhǔn)中心頻率。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每次稱取(2.00±0.01) g小麥樣品于直徑15 mm的核磁管中，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列測定樣品的橫向弛豫參數(shù)[18,19]，每組樣品6個(gè)平行，重復(fù)3次，取平均值。設(shè)置CPMG脈沖序列的參數(shù)如下：主頻SF=19 MHz， 90°脈沖射頻脈寬P1=13 us，180°脈沖射頻脈寬P2=25 μs，采樣頻率SW=200 kHz，回波時(shí)間TE=0.2 ms，重復(fù)采樣等待時(shí)間TW=1 500 ms，回波個(gè)數(shù)NECH=3 000，重復(fù)采樣次數(shù)NS=32。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用LF-NMR自帶的CONTIN反演法對數(shù)據(jù)進(jìn)行反演，用EXCEL(2013)軟件對反演數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖，用SAS9.4軟件進(jìn)行顯著性差異分析，用SAS9.4的DISCRIM程序?qū)λ械姆诸惸Ｐ蛿?shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練(Statistical Analysis Systems Institute, Inc., Cary, NC, USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟X射線圖片分析

玉米象是典型的糧食隱蔽性害蟲，成蟲產(chǎn)卵后將卵埋置于糧粒內(nèi)部，幼蟲在糧粒內(nèi)生長發(fā)育，直至長成成蟲從糧粒內(nèi)部羽化而出，玉米象是主要的初期性害蟲，會(huì)引起后期性蟲害滋生，造成嚴(yán)重的糧食損失[20]，因此實(shí)現(xiàn)玉米象的早期檢出顯得尤為重要。玉米象在同一粒小麥體內(nèi)的生長周期經(jīng)軟X射線檢測后得到的圖片如圖1所示，未感染小麥由于未受到蛀蝕，整體質(zhì)地比較均勻，當(dāng)小麥?zhǔn)艿接衩紫蟾腥局?，被蛀蝕以及產(chǎn)卵部分就會(huì)比較明亮。從圖中可以看出，小麥?zhǔn)芨腥?2 d玉米象處于卵期階段，感染的16 d～24 d分別為1～4齡幼蟲，1齡幼蟲體積較小而且在小麥內(nèi)部活動(dòng)范圍很小，沒有大范圍的侵蝕糧粒，感染的28 d玉米象處于蛹期階段然后漸漸長成成蟲并羽化而出。

圖1 未感染小麥與被不同天數(shù)玉米象感染小麥的軟X射線圖片

2.2 玉米象在小麥體內(nèi)生長階段的分類結(jié)果分析

紋理特征描述的是圖像表面的紋理信息，從宏觀上反映了一些圖像灰度變化的規(guī)律[21]。未感染小麥與被玉米象不同階段感染小麥的表面紋理特征存在差異，因此紋理特征可用于不同感染階段小麥的分類判別。本文共提取了30個(gè)紋理特征，用LDA與QDA分類模型進(jìn)行判別分析，從表1可以看出，兩種分類結(jié)果LDA的準(zhǔn)確率普遍比QDA高，將未感染小麥與玉米象卵期、幼蟲、蛹期及蛀空糧粒同時(shí)進(jìn)行分類判別，LDA與QDA模型對未感染小麥的分類準(zhǔn)確率最高，達(dá)到了90%以上。LDA模型對玉米象卵期、幼蟲、蛹期及蛀空糧粒的分類準(zhǔn)確率都在70%以上，卵期的分類準(zhǔn)確率為74.3%，相較于Chelladurai 等[7]的研究，準(zhǔn)確率有所提高；QDA模型的分類準(zhǔn)確率隨著玉米象的生長發(fā)育而逐漸提升。把卵期、幼蟲以及蛹期統(tǒng)一歸為感染階段與未感染小麥及蛀空糧粒進(jìn)行分類判別，發(fā)現(xiàn)兩種判別模型對于未感染及感染小麥的判別準(zhǔn)確率都在90%以上，相對來說，蛀空糧粒的判別準(zhǔn)確率就有點(diǎn)低，因?yàn)橹占Z粒往往會(huì)與蛹期感染小麥發(fā)生錯(cuò)誤分類。

表1 利用LDA與QDA分類模型對未感染小麥與受不同階段

為了得到未感染小麥與各個(gè)感染時(shí)期的分類準(zhǔn)確率，將未感染小麥與各個(gè)不同感染時(shí)期分別進(jìn)行分類判別。從表2可以看出，LDA與QDA模型對于所有感染類型的判別準(zhǔn)確率都達(dá)到了95%以上，有的甚至為100%，未感染小麥與受玉米象卵期感染小麥兩者之間較高的判別準(zhǔn)確率可以表明在高清X光機(jī)的幫助下，能夠清楚看到蛀蝕孔及卵的存在，因此有可能實(shí)現(xiàn)隱蔽性害蟲玉米象的早期檢出。

表2 利用LDA與QDA分類模型對未感染小麥與受不同階段

2.3 玉米象在小麥體內(nèi)生長發(fā)育的低場核磁分析

在LF-NMR中，常以氫核(1H)作為研究對象，弛豫時(shí)間用氫質(zhì)子的橫向弛豫時(shí)間表示[22]，小麥和玉米象的氫質(zhì)子主要來源于水分子。一般情況下，昆蟲的含水量遠(yuǎn)高于糧食的水分。例如，昆蟲的水分約為65%，而糧食的正常儲(chǔ)藏水分為12%～18%[14]。根據(jù)核磁共振弛豫時(shí)間T2反演譜圖中波峰位置的不同，可以區(qū)分處于不同狀態(tài)的水分。當(dāng)水與物質(zhì)結(jié)合越緊密時(shí)，相對質(zhì)子自由度就越低，T2弛豫時(shí)間就越短；相反質(zhì)子自由度越高時(shí)T2弛豫時(shí)間就越長[23]。結(jié)合高清X光機(jī)，在玉米象不同生長天數(shù)，挑選小麥內(nèi)部只受一頭玉米象感染的籽粒進(jìn)行低場核磁檢測，所得的T2反演圖譜如圖2所示，隨著感染天數(shù)的增加，第一特征峰的峰頂點(diǎn)呈現(xiàn)先向右后向左移動(dòng)的趨勢，此峰代表的是小麥的特征峰(弛豫時(shí)間范圍在0.47～1.14 ms之間)，表明受玉米象感染小麥內(nèi)部的水分流動(dòng)性發(fā)生了改變，那是因?yàn)橛衩紫笤谛←渻?nèi)部生長發(fā)育，直接取食小麥籽粒，導(dǎo)致小麥內(nèi)部的大分子結(jié)構(gòu)遭到破壞。而且除36 d以外，隨著感染天數(shù)的增加，第二特征峰表現(xiàn)的越來越明顯，此峰代表的是小麥內(nèi)部玉米象的特征峰(弛豫時(shí)間范圍在43.29～200.92 ms之間)，36 d時(shí)，玉米象成蟲已經(jīng)鉆出糧粒，蛀空糧粒相較于未感染及被感染小麥的水分含量都有所降低，導(dǎo)致峰的信號強(qiáng)度相對較弱。

圖2 玉米象在小麥體內(nèi)不同生長天數(shù)的低場核磁弛豫時(shí)間T2反演圖譜

峰值比例的變化能更加直觀的反映玉米象在小麥內(nèi)部的生長發(fā)育情況。如圖3所示，隨著玉米象在小麥內(nèi)部生長發(fā)育，峰值比例P2b呈先下降后上升的趨勢，峰值比例P22呈先上升后下降的趨勢，在感染的12 d，變化幅度非常細(xì)小，那是因?yàn)榇藭r(shí)的玉米象正處于卵期，還未開始蛀蝕糧粒，所以對小麥水分含量的影響可以忽略不計(jì)。從感染的12 d到24 d，峰值比例P2b與P22的變化幅度最大，P22所占比例從9.81%上升到了33.05%，此階段的玉米象孵化完成，從1齡幼蟲長成4齡幼蟲，在小麥體內(nèi)活躍度增強(qiáng)，體積不斷變大，所以通過LF-NMR檢測顯示蟲峰信號逐漸增強(qiáng)，所占比例逐漸增加。從感染的24 d到30 d，峰值比例P2b與P22表現(xiàn)的非常平穩(wěn)，P22所占比例都維持在31%以上，此時(shí)的玉米象正處于蛹期變態(tài)過程，蟲體在小麥體內(nèi)保持靜止?fàn)顟B(tài)，不取食糧粒。待其逐漸長成成蟲，由于成蟲水分含量相較于幼蟲與蛹期水分含量有所降低，因此峰值比例P22略有下降。在感染的36 d，成蟲羽化而出，此時(shí)的蛀空糧粒P2b急劇上升，P22急劇下降。

圖3 玉米象在小麥體內(nèi)生長發(fā)育過程的峰比例P2b和P22的變化情況

3 討論與結(jié)論

本研究通過高清軟X射線拍攝的被玉米象感染小麥圖片，可以清楚看到玉米象在小麥內(nèi)部生長發(fā)育的全部過程，并能觀察到在12%水分含量小麥中，玉米象在12 d左右孵化完成，整個(gè)玉米象的生長周期大約為36 d。

通過提取不同蟲態(tài)玉米象感染小麥的紋理特征，利用LDA與QDA進(jìn)行分類判別，兩者都可以對未感染小麥與不同感染階段小麥進(jìn)行分類，對未感染小麥的分類準(zhǔn)確率都在90%以上，并且對未感染小麥與不同感染階段小麥進(jìn)行單獨(dú)分類判別時(shí)，準(zhǔn)確率都達(dá)到了95%以上，尤其是未感染小麥與受卵期感染小麥的分類準(zhǔn)確率要比先前的研究高很多，例如Chelladura等[7]利用LDA與QDA分類模型研究未感染大豆與受四紋豆象卵期感染大豆的判別準(zhǔn)確率大約為60%，較之于Karunakaran等[5]的研究，本文增加了對玉米象卵期的檢測。對玉米象卵期及幼蟲階段較高的判別準(zhǔn)確率表明高清軟X射線有可能實(shí)現(xiàn)隱蔽性害蟲玉米象的早期檢出。

結(jié)合高清軟X射線拍攝的圖片進(jìn)行低場核磁檢測，根據(jù)玉米象與小麥特征峰值比例的變化，能夠判斷小麥?zhǔn)欠袷艿接衩紫蟾腥?，并且處于哪一種蟲態(tài)。因此能夠?qū)⒌蛨龊舜艡z測技術(shù)引入儲(chǔ)糧害蟲檢測領(lǐng)域，與高清軟X射線相結(jié)合，以期為糧食隱蔽性害蟲的早期檢出提供一種新的思路與方法。