趙 剛 閆 冰 劉鑫瑩

(哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司,黑龍江哈爾濱 150069)

目前國內(nèi)Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)均采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝，由于受到轉(zhuǎn)瓶表面積和培養(yǎng)條件的限制，生產(chǎn)細(xì)胞密度低，勞動強度大，操作過程易污染，疫苗質(zhì)量難以得到保證。自從60年代微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)建立以來，國外許多國家對其在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛研究，本研究采用Marc-145細(xì)胞微載體培養(yǎng)，并對培養(yǎng)過程中的各項技術(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而總結(jié)出一套較為合理的生產(chǎn)工藝，為Marc-145細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)提供可靠的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與微載體 Marc-145細(xì)胞（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），微載體 Cytodex1（購自美國GE公司）。

1.1.2 試劑與儀器 新生牛血清（濟(jì)南勁牛生物科技有限公司）；0.25%胰酶（美國Gicbo公司）；MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；結(jié)晶紫細(xì)胞裂解液有哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心配制；立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher，參數(shù)設(shè)置：37℃，5% CO2）；細(xì)胞培養(yǎng)磁力攪拌器（美國Wheaton）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 Marc-145細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)

將細(xì)胞凍存管自液氮罐中取出，置37 ℃水浴，使管內(nèi)凍存液迅速融化。常溫1000 r/min，離心5 min。棄去上清，用少量細(xì)胞生長液將細(xì)胞重懸后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入10 ml細(xì)胞生長液，于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞長成單層后，用胰酶消化液消化，并按1：3的比率進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2 微載體預(yù)處理

稱取所需質(zhì)量的微載體Cytodex-1，按100 ml：1 g的比例用PBS浸泡微載體，輕微攪拌使微載體均勻浸泡3 h，121 ℃、滅菌30 min；倒掉PBS，以30 ml：1 g的比例用培養(yǎng)基將微載體洗滌2次，將微載體放置在4 ℃冰箱內(nèi)平衡過夜，待用。

1.2.3 微載體細(xì)胞計數(shù)

取1 ml含微載體的培養(yǎng)液，900 r/min離心5 min，后棄掉上清，加入與上清相同體積的0.1%結(jié)晶紫溶液，混勻后于37 ℃中孵育1 h，然后用血球計數(shù)板計數(shù)釋放出來的細(xì)胞核，即為1ml培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 微載體培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞試驗條件的優(yōu)化

（1）攪拌轉(zhuǎn)速的確定

以微載體Cytodex-1用量為2 g/L、細(xì)胞接種密度為2×105cells/mL，加入細(xì)胞生長液后分別設(shè)定轉(zhuǎn)速為30、40和50 rpm培養(yǎng)細(xì)胞，每天取樣，觀察微載體上細(xì)胞吸附和生長情況，并采用結(jié)晶紫方法計數(shù)，確定出合適的攪拌速度。

（2）Marc-145細(xì)胞接種密度的確定

微載體Cytodex-1用量為2 g/L，分別以0.5×105、1.0×105、2.0×105和4.0×105cells/mL密度接種細(xì)胞。每天取樣，觀察微載體上細(xì)胞吸附和生長情況，并采用結(jié)晶紫方法計數(shù)，確定出合適的接種密度。

（3）微載體含量的確定

按照確定的接種密度2.0×105cells/mL與微載體用量2 g/L的比例關(guān)系，即在cells/g微載體相同的條件下接種Marc-145細(xì)胞，考察Cytodex-1含量分別為1 g/L、2 g/L、4 g/L微載體上細(xì)胞吸附和生長情況，并采用結(jié)晶紫方法細(xì)胞計數(shù)，確定出合適的微載體含量。

2 結(jié)果

2.1 Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)

Marc-145細(xì)胞于傳代后3 d即可長成致密單層（圖1），在顯微鏡下可以觀察到，細(xì)胞形態(tài)良好，透光性好，界限清晰。

圖1 Marc-145細(xì)胞

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速的確定

當(dāng)轉(zhuǎn)速分別為30、40、50 rpm時培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞生長情況如圖2所示。從圖中可以看出，在培養(yǎng)過程中隨著攪拌速度的增加，細(xì)胞最大生長密度先升高后降低，當(dāng)攪拌速度為40 rpm時，細(xì)胞密度最大為1.4×106cells/mL，培養(yǎng)效果最理想。因此本試驗攪拌速度采用40 rpm。

圖2 不同攪拌速度細(xì)胞生長曲線

2.3 細(xì)胞接種密度的影響

當(dāng)微載體Cytodex-1用量為2 g/L，以0.5×105、1.0×105、2.0×105和4.0×105cells/mL密度接種細(xì)胞。每天取樣分析，細(xì)胞生長動力學(xué)過程如圖3所示。

從圖3可以看出，當(dāng)微載體含量相等，接種密度不同時，細(xì)胞生長趨勢與文獻(xiàn)報道相似[75]。以0.5×105、1.0×105cells/mL接種時，接種密度低時，接種后84 h內(nèi)仍在緩慢生長，沒有進(jìn)入穩(wěn)定生長期的明顯標(biāo)志，而且細(xì)胞密度也比較低；而以2.0×105和4.0×105cells/mL接種細(xì)胞時，接種密度高，細(xì)胞在接種后60 h即開始進(jìn)入穩(wěn)定生長期，細(xì)胞密度較高都在1.4×106cells/mL以上。因此綜合考慮，本試驗選擇細(xì)胞的接種密度是2.0×105cells/mL。

圖3 不同接種密度Marc-145細(xì)胞生長曲線

2.4 微載體含量的確定

在微載體濃度為1 g/L、2 g/L、4 g/L的不同試驗條件下，每天分別從培養(yǎng)瓶中取樣并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果顯示當(dāng)培養(yǎng)瓶中微載體的濃度為4 g/L時，培養(yǎng)到72 h時細(xì)胞密度最大為1.8×106cells/mL，培養(yǎng)效果最理想。細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果如圖4所示，因此本試驗微載體含量采用4 g/L。

圖4 不同Cytodex-1濃度對Marc-145細(xì)胞生長曲線

3 討論

本研究通過設(shè)置不同攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞接種密度和微載體含量3個條件，研究了不同培養(yǎng)條件對Marc-145細(xì)胞生長的影響。

適當(dāng)?shù)臄嚢杷俣葘τ谖⑤d體懸浮培養(yǎng)是非常重要的，若攪拌轉(zhuǎn)速過低，微載體有沉降的趨勢，細(xì)胞不僅不能均勻生長，而且會發(fā)生結(jié)團(tuán)。若轉(zhuǎn)速提高，會促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和供氧，有利于細(xì)胞的生長。但當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時，雖然細(xì)胞與微載體的接觸機率會相應(yīng)的提高，但剪切力增加，對細(xì)胞的損傷也隨之增加，同時微載體間連接的細(xì)胞橋也會斷裂，細(xì)胞被拉長，裂解死亡。

當(dāng)微載體含量相等時，以不同密度接種細(xì)胞，每個載體顆粒上開始的細(xì)胞數(shù)量不相同，細(xì)胞接種密度高時，每個微載體上的細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞在載體上分布比較均勻，細(xì)胞生長的空間大，不會或很少受到生長面積的限制，而且細(xì)胞消耗的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的積累也相應(yīng)降低，因此，細(xì)胞表現(xiàn)出較高的平均比生長速率。但細(xì)胞接種密度也不應(yīng)過高，過高時由于受到生長面積的限制，細(xì)胞的擴(kuò)展受到影響，使得平均比生長速率降低，同時降低了載體利用率。

本試驗比較了在不同微載體濃度Marc-145細(xì)胞的增殖狀況，摸索出了培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞時最合適的微載體加入量，認(rèn)為當(dāng)加入的微載體顆粒濃度為4 mg/mL時，接種Marc-145細(xì)胞后是最有利于細(xì)胞增殖的，此時收獲的Marc-145細(xì)胞數(shù)量最多。另外，微載體濃度過高時，在懸浮培養(yǎng)的過程中顆粒之間相互碰撞的機率就會大大增加，造成微載體顆粒破碎和細(xì)胞脫落；另一方面，高含量載體培養(yǎng)時，在攪拌時，載體間碰撞幾率增加，會增加碰撞損傷細(xì)胞的機會，這也不利于細(xì)胞培養(yǎng)，而且，細(xì)胞的生長狀況如果不好，也會影響到接下來的病毒增殖過程。因此本試驗選擇的微載體濃度最高為4 g/L。

4 結(jié)論

攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞接種密度和微載體含量都會對Marc-145細(xì)胞增殖造成一定的影響，只有細(xì)胞生長條件適宜，才會最大程度的使細(xì)胞增殖，并達(dá)到預(yù)期效果，既設(shè)定攪拌速度為40 rpm、細(xì)胞接種密度為4.0×105cells/ml、微載體含量為4 g/L，培養(yǎng)72 h時，微載體上細(xì)胞匯合度大于90%，細(xì)胞密度最大為2.0×106cells/ml。