段志剛

（鄭州市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南鄭州 450002）

隨著社會(huì)不斷進(jìn)步，畜產(chǎn)品衛(wèi)生與安全備受關(guān)注。大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）是腸出血性大腸桿菌（簡(jiǎn)稱(chēng)EHEC）的主要血清型，雖是條件致病菌但致病力強(qiáng)，我國(guó)自1988年，已有江蘇等省市從腹瀉病患者分離到O157：H7。根據(jù)大眾網(wǎng)濟(jì)南2017年7月27日訊，濟(jì)南檢驗(yàn)檢疫局首次在濟(jì)南空港口岸從臺(tái)灣入境中國(guó)籍旅客中檢出大腸桿菌O157感染病例。為了解本市市售生鮮豬肉中是否存在O157：H7，我們分別于2017年10～12月，2018年2～3月分兩組對(duì)鄭州市部分市售生鮮肉進(jìn)行了大腸桿菌的分離鑒定，并采用雙重PCR法對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 待檢樣品

檢測(cè)生鮮豬肉樣品分別來(lái)自儉學(xué)街思達(dá)超市、儉學(xué)街雙匯連鎖店、信息學(xué)院路丹尼斯超市和金城冷鮮肉四個(gè)地點(diǎn)，分3個(gè)批次，共27份。

1.2 主要的儀器、培養(yǎng)基、試劑

儀器：OLYMPUS光學(xué)顯微鏡；Bio-rad PCR擴(kuò)增儀等。

培養(yǎng)基：亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、伊紅美蘭瓊脂（EMB）、膽硫乳培養(yǎng)基（DHL）、普通肉湯、甘油等。

PCR反應(yīng)試劑：2×PCR TaqMix；引物的設(shè)計(jì)與合成：設(shè)計(jì)大腸桿菌O157：H7的O157菌體抗原rfbE基因和H7鞭毛抗原fliC基因?yàn)榘谢驅(qū)?yīng)的引物，由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成[2，3]。

基因 引物 序列 擴(kuò)增片段rfbE RfbE-F 5’-CTACAGGTGAAGGTGGAATGG-3’ 327bp RfbE-R 5’-TTCCTCTCTTTCCTCTGCGG-3’fliC FliC-F 5’-TACCATCGCAAAAGCAACTCC-3’ 247bp FliC-R 5’-GTCGGCAACGTTAGTGATACC-3’

1.3 程序和方法

1.3.1 樣品制備

取20g樣品剪碎與含有180ml的滅菌生理鹽水，充分研磨制成1：10樣品勻液。

1.3.2 選擇性增菌

將1：10樣品勻液取25ml接入SC增菌液，36℃培養(yǎng)18～24h。

1.3.3 分離純化

挑取增菌液，接種于EMB平板和DHL平板，36℃培養(yǎng)18～24h，挑取可疑菌落接種普通肉湯，再次劃線分離，直至得到純化的菌落為止。

1.3.4 鏡檢保存

1.3.5 三糖鐵（TSI）試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、動(dòng)力-硝酸鹽試驗(yàn)等生化項(xiàng)目檢驗(yàn)。

1.3.6 雙重PCR法檢驗(yàn)

（1）制備細(xì)菌模板DNA。

（2）PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃10min。

（3）凝膠電泳試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 分離菌形態(tài)與染色特性

革蘭氏染色鏡檢，為革蘭氏陰性菌，紅色，菌體兩端鈍元，中等大小，呈桿狀，不產(chǎn)生莢膜，無(wú)芽孢，符合大腸桿菌形態(tài)染色特性。

2.2 分離菌培養(yǎng)特性

普通肉湯中培養(yǎng)18～24h，出現(xiàn)均勻渾濁，底部粘性沉淀物，伴有臭味，表面形成一層菌膜，符合大腸桿菌在普通肉湯中培養(yǎng)特性。伊紅美藍(lán)平板上培養(yǎng)24h，出現(xiàn)紫黑色菌落，有時(shí)帶綠色金屬光澤，光滑，突起。在DHL板上培養(yǎng)24h，出現(xiàn)粉紅菌落，光滑，突起。符合大腸桿菌在EMN和DHL平板上的培養(yǎng)特性。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

初步判定有74株是大腸桿菌典型陽(yáng)性菌株，不能判斷是否有大腸桿菌0157：H7。

2.4 大腸埃希菌O157：H7的檢測(cè)結(jié)果

74株大腸桿菌，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，有1株與大腸桿菌O157：H7標(biāo)準(zhǔn)菌株的目的片段（247bp和327bp）一致，為陽(yáng)性菌株。其余73個(gè)菌株均為陰性。如圖1所示。

3 分析與討論

本次試驗(yàn)在74份生鮮豬肉樣品中檢出1株大腸桿菌0157：H7，說(shuō)明本市生鮮豬肉品中存在威脅民眾身體健康的食源性病原菌，需重視其質(zhì)量安全。

要想控制大腸桿菌O157：H7對(duì)食品的污染，首先，從生豬養(yǎng)殖到屠宰嚴(yán)格按照動(dòng)物防疫法做好消毒防疫檢疫。其次，建立實(shí)用高效的檢測(cè)手段。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前較為先進(jìn)的技術(shù)，特異性好、靈敏度高，讀取結(jié)果精確直觀，已成為食源性致病菌檢測(cè)的重要方法。本試驗(yàn)雖然采用普通PCR檢測(cè)，但依然有相當(dāng)高的可信度。再次，加強(qiáng)立法工作，完善相關(guān)法律法規(guī)，增強(qiáng)從業(yè)人員的主體責(zé)任和衛(wèi)生意識(shí)，同時(shí)加強(qiáng)市場(chǎng)檢測(cè)力度。