余久如，盧錦蓮，廖建紅，蔡維望

(1.黃石市第二醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科；b.腎病內(nèi)科，湖北黃石 435002；2.黃石醫(yī)養(yǎng)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，湖北黃石 435004)

羥苯磺酸鈣作為改善微循環(huán)、抗血栓的藥物臨床使用較為常見(jiàn)，使用者中也包括一些腎功能不全的患者。這部分患者使用羥苯磺酸鈣后肌氨酸氧化酶法血清肌酐大幅降低，導(dǎo)致患者認(rèn)為該藥物有明顯的改善腎功能作用[1-2]。羥苯磺酸鈣對(duì)肌氨酸氧化酶法血清肌酐檢測(cè)的干擾已被體外干擾試驗(yàn)所證實(shí)[3]，且從干擾試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，腎功能不全患者血清中可能存在較高濃度的羥苯磺酸鈣。健康人單次口服羥苯磺酸鈣藥代動(dòng)力學(xué)報(bào)道[4-6]較多，未見(jiàn)穩(wěn)態(tài)血藥濃度報(bào)道。

本研究借鑒血清羥苯磺酸鈣高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定的文獻(xiàn)[5-6]，采用HPLC法檢測(cè)患者服用羥苯磺酸鈣后穩(wěn)態(tài)血清藥物濃度，觀察腎功能不全患者同非腎功能不全患者間的藥物濃度的差異，分析藥物濃度與腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)及肌氨酸氧化酶法肌酐干擾值相關(guān)性。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇于2016年5～10月間黃石市第二醫(yī)院收治服用羥苯磺酸鈣劑量為1.5 g/d(Tid)的患者30例。其中，腎功能不全組：20例慢性腎臟病患者(符合K/DOQI指南診斷標(biāo)準(zhǔn))，男性13例，女性7例，年齡56.6(37～68)歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：有腎功能不全(血清酶法肌酐高于120 μmol/L)。非腎功能不全組：本院收治非腎功能不全患者10例，男性7例，女性3例，年齡54.3(32～71)歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)腎功能不全(血清酶法肌酐低于90 μmol/L)。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)均為：有明顯心、肺及肝功能障礙者，發(fā)熱及血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于參考范圍者，未按規(guī)定劑量服藥者。兩組均采集患者羥苯磺酸鈣服藥5天后清晨空腹靜脈血，分離血清-40℃保存待測(cè)。本研究征得患者知情同意，藥物的使用僅依據(jù)病情的需要。

1.2 試劑和儀器 儀器：島津LC-20AT高效液相色譜儀，八方世紀(jì)BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x，上海精科雷磁PXSI-226離子計(jì)，sigma3K15離心機(jī)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司QL-901渦旋振蕩器；美國(guó)ABBOTT公司ARCHITECT C8000全自動(dòng)生化分析儀，日本富士膠片株式會(huì)社FUJIFILM DRI-CHEM4000ie干式生化分析儀。

藥品與試劑：口服羥苯磺酸鈣為西安利君制藥公司產(chǎn)品(0.5g/粒)；羥苯磺酸鈣對(duì)照品(含量94.8%，批號(hào)：100573-201503)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)氨基苯甲酸對(duì)照品(含量99.8%，批號(hào)：100017-201210)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；磷酸(分析純)購(gòu)自武漢市中天化工有限責(zé)任公司；磷酸二氫鉀(分析純)、四丁基氫氧化銨水溶液(10%，分析純)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈(高效液相色譜純)購(gòu)自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；水為二次去離子水；肌氨酸氧化酶法肌酐試劑購(gòu)自浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司；半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C)試劑購(gòu)自寧波瑞源生物科技有限公司；脫亞胺酶法肌酐試劑購(gòu)自日本富士膠片株式會(huì)社；質(zhì)控品購(gòu)自英國(guó)RANDOX公司；空白血清為未服藥物且排除心、肝、腎等常見(jiàn)疾病的健康體檢者混合血清。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-SP柱(5 μm，4.6*250mm，日本GL Sciences公司)，保護(hù)柱ODS-SP柱(5 μm，4.0*10mm，日本GL Sciences公司)；流動(dòng)相：0.05 mol/L pH 3.0磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈(85∶15，v/v)，流動(dòng)相中含0.1 mg/dl四丁基氫氧化銨[7]；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：300 nm；柱溫：35℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)液配制：稱取羥苯磺酸鈣對(duì)照品200 mg(相當(dāng)于羥苯磺酸鈣189.6 mg)，用100 ml容量瓶加去離子水至刻度溶解成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液。用去離子水稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液配成濃度為19.0，37.9，94.8，189.6，474.0，948.0和1 896.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列儲(chǔ)存液；內(nèi)標(biāo)為對(duì)氨基苯甲酸，用去離子水配成50 mg/L濃度的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存液。上述儲(chǔ)存液4℃避光冷藏備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測(cè)樣品)處理：吸取0.25 ml空白血清(患者血清)于2.5 ml具塞尖底塑料離心管中，加入標(biāo)準(zhǔn)系列儲(chǔ)存液 (去離子水)25 μl，加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存液(50 mg/L)25 μl，混勻后加入1 ml乙腈沉淀蛋白，旋渦振蕩1 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液0.65 ml于試管中，氮?dú)獯蹈珊蠹?50 μl流動(dòng)相溶解，混勻后取20 μl進(jìn)樣分析。

1.3.4 萃取回收率：取94.8，474.0，1 896.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列儲(chǔ)存液，按“標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測(cè)樣品)處理”法處理進(jìn)樣分析，每種濃度平行做6份，得到萃取后峰面積。另取上述標(biāo)準(zhǔn)系列儲(chǔ)存液，除用去離子水替換空白血清外，其它按“標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測(cè)樣品)處理”法處理，每種濃度平行做2份，取峰面積均值作為對(duì)照計(jì)算羥苯磺酸鈣及內(nèi)標(biāo)萃取回收率。

1.3.6 準(zhǔn)確度及精密度：取空白血清標(biāo)本，以9∶1比例分別加入189.6，948.0，1896.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液(對(duì)照加去離子水)配制3份濃度為18.96，94.80，189.60 mg/L的加標(biāo)測(cè)試樣品和1份對(duì)照樣品，每份樣品按“標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測(cè)樣品)處理”法分別處理并進(jìn)樣檢測(cè)，每天每種樣品檢測(cè)2次，連續(xù)5天，計(jì)算加標(biāo)回收率、日內(nèi)及日間精密度。

1.3.7 患者血清檢測(cè)：按“標(biāo)準(zhǔn)系列(檢測(cè)樣品)處理”法檢測(cè)穩(wěn)態(tài)血藥濃度，并同期檢測(cè)其Cystatin C，肌氨酸氧化酶法肌酐和脫亞胺酶法肌酐。

2結(jié)果

2.1 方法專屬性 在1.3.1色譜條件下，空白血清、空白血清加內(nèi)標(biāo)、空白血清加內(nèi)標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)液及1名患者血清色譜圖見(jiàn)圖1。羥苯磺酸鈣、對(duì)氨基苯磺酸內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為：6.9和8.0min。色譜圖表明，血清內(nèi)源性物質(zhì)不干擾羥苯磺酸鈣測(cè)定。

A.空白血清；B.空白血清加內(nèi)標(biāo)；C.空白血清加內(nèi)標(biāo)和對(duì)照品；D.患者血清加內(nèi)標(biāo)。1.內(nèi)標(biāo)對(duì)氨基苯甲酸；2.羥苯磺酸鈣。

圖1血清羥苯磺酸鈣及內(nèi)標(biāo)對(duì)氨基苯甲酸HPLC色譜圖

2.2 萃取回收率 9.48，47.40，189.60 mg/L的羥苯磺酸鈣萃取回收率分別為：75.6%±1.22%，75.7%±1.48%，75.1%±1.29%；內(nèi)標(biāo)對(duì)氨基苯甲酸萃取回收率分別為：94.4%±1.14%，94.6%±1.32%，94.5%±1.38%；羥苯磺酸鈣及內(nèi)標(biāo)對(duì)氨基苯磺酸平均萃取回收率分別為：75.5%和94.5%。

2.3 線性范圍及檢測(cè)低限 標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為1.90，3.79，9.48，18.96，47.40，94.80和189.60 mg/L，以羥苯磺酸鈣與內(nèi)標(biāo)氨基苯磺酸峰面積比為橫坐標(biāo)(X)，以羥苯磺酸鈣濃度為縱坐標(biāo)(Y)，線性回歸方程為：Y=33.733X-0.108 6(r2=0.999 1，P<0.01)。線性范圍：1.90～189.60 mg/L，檢測(cè)低限：0.452 mg/L。

2.4 準(zhǔn)確度及精密度 平均加標(biāo)回收率為98.9%(95.6%～103.6%)；18.96，94.80和189.60 mg/L三種濃度測(cè)試樣品日內(nèi)CV分別為4.8%，4.5%和4.1%，日間CV分別為6.3%，6.1%和5.4%。

2.5 腎功能不全組、非腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣、eGFR檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。腎功能不全組和非腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度、eGFR檢測(cè)結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0．001)。

表1 兩組患者穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度及eGFR比較

2.6 腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與eGFR及肌酐干擾值相關(guān)性及回歸分析結(jié)果 腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與eGFR相關(guān)性顯著(r=-0.790，P=0.000)，回歸分析曲線見(jiàn)圖2，回歸方程為Y=608 0.61X-1.692(r2=0.975 3)，回歸方程顯著性檢驗(yàn)F=710.882，P=0.001；腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與肌酐干擾值相關(guān)性顯著(r=0.816，P=0.000)，回歸分析曲線見(jiàn)圖3，回歸方程為Y=0.002 7X2+0.343 5X+22.935(r2=0.987 5)，回歸方程顯著性檢驗(yàn)F=671.064，P=0.000。

圖2 腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與eGFR回歸曲線

圖3 腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與肌酐干擾值回歸曲線

3討論羥苯磺酸鈣化學(xué)名2，5二羥苯磺酸鈣，常用藥物及對(duì)照品(標(biāo)準(zhǔn)品)為一水合物，分子式為(C6H5O5S)2·Ca2+·H2O。其溶于水以離子形式存在。本文為便于比較，HPLC檢測(cè)中以無(wú)水羥苯磺酸鈣記其濃度。HPLC檢測(cè)羥苯磺酸鈣報(bào)道方法較多，鑒于其較強(qiáng)的極性，保留時(shí)間短，故多選用極性較強(qiáng)的色譜柱延長(zhǎng)保留時(shí)間。研究中也測(cè)試過(guò)不同pH及配比的流動(dòng)相，選取了分離度較好的流動(dòng)相配制方法。方法學(xué)評(píng)價(jià)顯示方法專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍均滿足檢測(cè)血清羥苯磺酸鈣濃度的需要。

由于服藥患者肌酐檢測(cè)受到干擾，且基于Cystatin C計(jì)算的eGFR較簡(jiǎn)化MDRD評(píng)估方程[8-9]應(yīng)用也較多，本文選用基于Cystatin C的eGFR評(píng)估患者的腎小球?yàn)V過(guò)功能。

文獻(xiàn)報(bào)道[4-6]健康人單次口服500mg羥苯磺酸鈣峰濃度(Cmax)9～18.0 mg/L，國(guó)秀芝等[10]報(bào)道HPLC法健康志愿者服藥(1.5 g/d，Tid)3天后的血藥峰濃度7.04～23.15 mg/L，與該研究非腎功能不全組基本吻合。同樣用藥劑量腎功能不全組穩(wěn)態(tài)藥物濃度數(shù)倍于非腎功能不全組，且肌氨酸氧化酶法肌酐測(cè)定的干擾值與藥物濃度呈顯著相關(guān)，也印證了藥物體外干擾劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)[3]。羥苯磺酸鈣主要以原形通過(guò)腎臟、腸道排泄，腎功能不全組穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度與eGFR呈顯著負(fù)相關(guān)，特別是當(dāng)eGFR低于12 ml(min·1.73m2)-1時(shí)，穩(wěn)態(tài)血清羥苯磺酸鈣濃度急劇升高，顯示eGFR對(duì)羥苯磺酸鈣排泄的重要影響。

鑒于腎功能不全患者常規(guī)劑量服用羥苯磺酸鈣后出現(xiàn)與eGFR呈負(fù)相關(guān)的藥物蓄積，建議腎功能不全患者使用羥苯磺酸鈣應(yīng)依據(jù)eGFR降低用藥劑量。