洪智，黃鶴，張起維，王宇，湯振，曾超

（皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院胃腸外科，安徽 蕪湖 241001）

21世紀，糖尿病成為了世界性公共健康問題。根據(jù)2017年中國2型糖尿病防治指南：全球約有4.25億糖尿病患者（2017年），我國成年糖尿病患病率亦從1986年的1.04%升高到2013年的10.4%，我國約有1.18億糖尿病患者，占全球的27%，居全球首位，其中又以2型糖尿病患者為主［1］。有研究表明中國2型糖尿病占糖尿病人群的93.7%［2］。在2010年后已經(jīng)有超過9 240萬的成人糖尿病患者和1.482億人次的前驅(qū)糖尿病患者［1，3］。對于肥胖合并2型糖尿病患者，減肥手術(shù)在有效改善肥胖的同時能很好地降低血糖，尤其是Roux-en-Y胃轉(zhuǎn)流術(shù)（RYGB）［4］。故自2016年國際糖尿病組織聯(lián)合申明將代謝手術(shù)也作為治療2型糖尿病的措施之一［5］。但對于代謝手術(shù)，尤其RYGB具體機制仍舊不是很清楚。有研究認為其改善血糖與體重減輕有關(guān)［6］，但也有研究認為體重減輕并非其主要原因［7］，而是與術(shù)后胃腸激素變化有重要關(guān)系［8］，為此Rubino等［9］開發(fā)出了十二指腸-空腸旁路術(shù)（duodenal-jejunal bypass，DJB），一種專注于腸道功能的RYGB保胃手術(shù)，用于闡明手術(shù)后血糖控制的相關(guān)機制。本實驗在此基礎(chǔ)上主要探究不同Roux腸袢長度對空腹血糖（FPG）及胰高血糖素樣肽（GLP-1）的影響，以及闡明其改善血糖的可能機制，從而來改進RYGB術(shù)式以期達到最佳手術(shù)效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 40只清潔級雄性2型糖尿病模型（Goto-Kakizaki，GK）大鼠，8周齡，體重（245±15）g，術(shù)前空腹血糖均大于7.0 mmol/L，購于上海斯萊克動物實驗有限公司，實驗動物許可證號SCXK（滬）2017-0005，均飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學無菌動物實驗房。采用抽簽法先將40只GK大鼠隨機分成5組，每組8只，分別為：對照組A組：離斷胃十二指腸處重新縫合組；手術(shù)組B～E組：保留Roux腸袢分別為10、20、30、40 cm的DJB組。

1.2 手術(shù)方法

1.2.1 術(shù)前準備 術(shù)前將GK大鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境2周，采用12 h光照，12 h黑暗以及合適的溫度和濕度飼養(yǎng)，按時喂食，飲水不斷。在術(shù)前禁食12～16 h，予以5%葡萄糖氯化鈉液供大鼠飲用，術(shù)前2 h禁止飲水。術(shù)前予以1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，按1 ml/kg給藥，若大鼠術(shù)中蘇醒，可再次予以首次劑量的10%～15%。麻醉成功后進行備皮消毒鋪巾。

1.2.2 手術(shù)過程 將十二指腸與胃幽門部連接處離斷后重新縫合作為對照組A組；對于手術(shù)組則按照保留胃部的Roux-en-Y術(shù)式進行，離斷后的十二指腸殘端用0號細線進行間斷縫合；找到屈氏韌帶，于后延伸15 cm處離斷，再用遠端小腸于胃離斷端進行端端吻合（方法同前）；將近端小腸與距胃腸吻合口10、20、30、40 cm的Roux腸袢進行端側(cè)吻合分別作為手術(shù)組B組、C組、D組、E組；術(shù)后檢查各縫合處無出血滲血等關(guān)閉腹腔，完成手術(shù)。見圖1。

圖1 對照組和保留不同長度Roux腸袢DJB手術(shù)組

1.2.3 術(shù)后管理 術(shù)后對GK大鼠保暖保溫。每隔15 min觀察并變換大鼠體位一次，直至大鼠可活動。大鼠術(shù)后前3 d均予以5%葡萄糖氯化鈉液，3～4 d后改普通飼料喂養(yǎng)；術(shù)后第1天給予20萬U青霉素肌注，連續(xù)3 d。術(shù)后按時更換新墊料。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 檢測體重 分別于術(shù)前3 d，術(shù)后1、3、5、8周用電子天平動態(tài)測量5組GK大鼠的體重。

1.3.2 測定FPG及GLP-1 分別于術(shù)前3 d及術(shù)后1、3、5、8周取大鼠眼眶后靜脈血，采用血糖儀測定大鼠FPG水平；采用ELISA法檢測血清GLP-1，試劑盒購于武漢基因美科技有限公司。1.3.3 免疫組化分析（SP法） 術(shù)后8周從各組大鼠獲取胃腸吻合處、十二指腸殘端的屈氏韌帶處及共同通路空腸處的組織標本（圖1中①②③），制備石蠟切片，采用SP法，抗體采用兔抗大鼠GCG（GLP-1）多克隆抗體（南京愛貝生物科技公司），SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購于南京建成技術(shù)有限公司，嚴格按照說明進行操作。并對統(tǒng)計結(jié)果OD值進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用重復測量方差分析，組間比較采用LSD法，組內(nèi)比較采用Dunnettt檢驗，其他兩組之間比較則采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GK大鼠的手術(shù)成功率及術(shù)后存活情況 以臨床圍手術(shù)期為大致標準，一般胃腸手術(shù)7～10 d出院，本研究定義在術(shù)中及術(shù)后1周之內(nèi)為手術(shù)成功率。5組40只大鼠的手術(shù)成功率為72.5%，但在8周這段時間總存活率為60%。其中DJB手術(shù)組B、D、E組術(shù)后各死亡3只，C組術(shù)后死亡2只，但在隨后E組相繼死亡，對照組和其它手術(shù)組存活大鼠存活良好。

2.2 體重變化 術(shù)前各組GK大鼠的體重差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術(shù)后1周時，對照組與手術(shù)組均有所下降且對照組A和手術(shù)組C、D、E組和本組術(shù)前比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各組術(shù)前與術(shù)后5、8周比較差異無統(tǒng)計學意義；術(shù)后5、8周剩余手術(shù)組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 對照組與不同Roux腸袢長度DJB手術(shù)組GK大鼠術(shù)前和術(shù)后的體重變化（g，±s）

表1 對照組與不同Roux腸袢長度DJB手術(shù)組GK大鼠術(shù)前和術(shù)后的體重變化（g，±s）

注：術(shù)后1周B、D、E組術(shù)后各死亡3只，C組術(shù)后死亡2只；術(shù)后3～5周E組又死亡3只，剩余2只未做統(tǒng)計學分析。與術(shù)前比較，1）P＜0.05

組別對照組A組手術(shù)組B組手術(shù)組C組手術(shù)組D組手術(shù)組E組整體分析F，P組間比較時間比較組間*時間術(shù)前3 d 243.18±6.52 236.86±5.06 245.68±11.20 237.56±4.52 242.54±7.43術(shù)后1周229.94±7.841）216.12±28.38 217.73±2.901）212.46±6.601）215.38±4.981）術(shù)后3周237.79±10.03 227.96±7.70 229.58±5.171）227.90±5.75 229.04±5.161）術(shù)后5周245.55±10.07 241.66±6.79 242.02±6.73 237.36±4.79—術(shù)后8周252.30±9.20 247.60±5.94 252.17±8.25 244.88±9.14—球形檢驗校正HF系數(shù)：0.538 2.871、0.062 52.903、0.000 0.908、0.504

2.3 FPG水平的變化 術(shù)前各組GK大鼠的FPG水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組術(shù)后1、3周較術(shù)前有所下降（P＜0.05），但術(shù)后5、8周差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各DJB手術(shù)組術(shù)后1、3、5、8周與術(shù)前比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；手術(shù)組與對照組術(shù)后同一時間點FPG比較差異均有統(tǒng)計學意義，手術(shù)組D、E組較B、C組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），保留Roux腸袢較長的手術(shù)組E組降低血糖的效果更好。見表2。

2.4 GLP-1水平的變化 術(shù)前各組GK大鼠的GLP-1水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；對照組與DJB手術(shù)組術(shù)后均較術(shù)前GLP-1水平下降（P＜0.05）；各手術(shù)組術(shù)后同一時間點GLP-1水平與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；術(shù)后 1、3、5、8周手術(shù)組D、E組與手術(shù)組B、C組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；較長Roux腸袢的手術(shù)組，GLP-1降低越明顯，以E組為最，與對照組A組差異最明顯，但由于E組在第5周并無數(shù)據(jù)進行比較，不過D組與A、B、C組在術(shù)后5、8周GLP-1水平差異仍有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表2 對照組與不同Roux腸袢長度DJB手術(shù)組GK大鼠術(shù)前和術(shù)后FPG水平變化（mmol/L）

表3 對照組與不同Roux腸袢長度DJB手術(shù)組GK大鼠術(shù)前和術(shù)后空腹GLP-1水平變化（ng/L）

2.5 GLP-1受體表達情況 DJB手術(shù)組在胃腸吻合處、十二指腸殘端屈氏韌帶處及共同通路空腸處與對照組A組相比GLP-1受體表達明顯增多（P＜0.05），且保留Roux腸袢較長的D組中GLP-1受體表達較多，與手術(shù)組B、C組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但在十二指腸殘端屈氏韌帶處，手術(shù)組B、C、D與對照組A組相比卻明顯減少（P＜0.05）。見圖2、表4。

表4 對照組與不同Roux腸袢長度DJB手術(shù)組GK大鼠術(shù)前與術(shù)后8周的GLP-1受體表達比較（OD，IOD/μm2）

3 討論

糖尿病作為慢性病之一，已經(jīng)成為威脅人類健康的全球性問題，而作為大多數(shù)的2型糖尿病患者通常合并肥胖等代謝異常。而RYGB手術(shù)為肥胖的2型糖尿病患者提供了更有效的治療［10-12］。盡管許多研究已經(jīng)說明了 RYGB手術(shù)的作用機制，但仍有很多問題需要回答。這促使我們開展工作，尋求更多有效RYGB的手術(shù)。DJB作為RYGB的保胃模型，已被證明可提供顯著且持久的控制血糖、食物攝入量、體重或營養(yǎng)吸收［9，13］。根據(jù) DJB 手術(shù)特點，它被認為是低體重指數(shù)（BMI）的2型糖尿病患者的有效代謝手術(shù)［14］。臨床上，患有2型糖尿病的低BMI的患者用DJB治療可以有效控制血糖［15-17］。此外，在肥胖和非肥胖2型糖尿病大鼠模型中進行DJB手術(shù)，如 GK［18］，ZDF［13，19］和高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠［20］已被證明能顯著地改善血糖。但對于DJB術(shù)改善血糖的相關(guān)機制并未解釋清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，DJB通過增加膽汁酸和促進GLP-1分泌可以改善大鼠的胰島素抵抗［21］。研究發(fā)現(xiàn)DJB手術(shù)能有效改善血糖但與對照組相比體重變化并無明顯差異，其體重減輕并非降低血糖的主要因素，而是與胃腸激素的分泌相關(guān)，最主要的有GLP-1［22-23］。有相關(guān)研究表明增加GLP-1和GLP-1受體刺激可以改善葡萄糖耐量［22］。GLP-1主要分布于腸道的L細胞，故DJB手術(shù)的腸道解剖位置的改變可能是有效控制血糖的相關(guān)機制，但對于DJB術(shù)式的最佳方式現(xiàn)在仍無統(tǒng)一標準，故本實驗主要探討不同長度Roux腸袢的DJB術(shù)式對糖代謝的影響以及可能的機制。

圖2 對照組與不同Roux腸袢長度DJB手術(shù)組在不同腸段處的GLP-1受體的表達（免疫組化×100）

本研究結(jié)果表明手術(shù)組與對照組在術(shù)后體重變化上無統(tǒng)計學意義，但FPG在術(shù)后明顯改善，并且保留Roux腸袢較長組降低FPG的效果明顯（P＜0.05）。血清空腹GLP-1水平測定結(jié)果表明各DJB手術(shù)組在術(shù)后1、3周與對照組相比均明顯下降，并在各手術(shù)組間差異亦有統(tǒng)計學意義，其中以保留40 cm Roux腸袢的E組下降最明顯（P＜0.01）。但手術(shù)組E組大鼠后期存活量不足無法比較。從GLP-1受體在胃腸吻合處、十二指腸殘端屈氏韌帶處、共同通路空腸處的免疫組化的結(jié)果可知，隨著Roux腸袢的延長，在胃十二指腸連接處、共同通路空腸處GLP-1受體的表達明顯增多，而在十二指腸殘端屈氏韌帶處GLP-1受體表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。表明食物刺激提前進入空腸可以上調(diào)GLP-1受體，而缺少食物刺激的十二指腸GLP-1受體下調(diào)，但也有可能與GLP-1受體本身在腸道的分布有關(guān)。故本實驗說明較長Roux腸袢的DJB術(shù)能更有效地降低血糖，但體重變化不明顯，其機制可能是食物刺激，GLP-1受體上調(diào)，提高了GLP-1的結(jié)合率，促使血糖下降，負反饋于GLP-1，進而使餐前GLP-1逐漸降低。但隨著Roux腸袢延長，大鼠死亡率明顯增多，手術(shù)風險增加。

本實驗的不足之處手術(shù)組大鼠數(shù)量較少，結(jié)果可能存在偏差；本實驗并未測定餐后GLP-1的分泌情況；手術(shù)組E組術(shù)后3周后缺少數(shù)據(jù)以及實驗時間較短對于DJB術(shù)后的長期結(jié)果有何變化并不清楚；缺少術(shù)前GK大鼠GLP-1受體在腸段中的表達情況。故減肥手術(shù)改善血糖的具體機制還有待進一步探究，相信隨著實驗研究的深入，進一步了解其機制，選擇更有效的手術(shù)方式將為2型糖尿病患者帶來更多益處。