劉曉虹 靳亞莉 周曉維

麻風(fēng)是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，盡管從40年代起就開(kāi)展了以氨苯砜類藥物為主的化療，但迄今為止仍有多數(shù)國(guó)家尚未能達(dá)到控制和消滅麻風(fēng)。我國(guó)麻風(fēng)發(fā)病趨勢(shì)總體處于低流行狀態(tài)，仍位于世界前位[1]。麻風(fēng)桿菌(ML)是麻風(fēng)的病原體，在人體內(nèi)主要侵犯皮膚、黏膜、周圍神經(jīng)、淋巴結(jié)、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)以及橫紋肌等器官和組織。諸多研究表明其致病機(jī)制主要是由于機(jī)體對(duì)ML及其抗原成分發(fā)生的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的結(jié)果，麻風(fēng)桿菌種屬特異抗原酚糖脂I(PGL-I)，是麻風(fēng)血清學(xué)檢查使用最廣的抗原；使用單克隆和多克隆抗體法分析PGL-I分子上的抗原表位，表明其上3,6-二甲氧基葡糖殘基是重要的，并以此為基礎(chǔ)將其上的天然三糖結(jié)構(gòu)(Natural Trisaccharide)通過(guò)連接臂苯丙?；?Phenolic)或辛基(Octyl)連接到小牛血清蛋白(BSA)上而產(chǎn)生半合成糖蛋白抗原： NT-P-BSA，NT-O-BSA[2]。Izumi等[3]曾用NT-O-BSA建立明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)為現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。但其敏感性和特異性均較NT-P-BSA-IgM-ELISA低。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò) NT-P-BSA-IgM-ELISA(NT-IgM-ELISA)和NT-P-BSA-IgG-ELISA(NT-IgG-ELISA)的比較實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)兩法的敏感性和特異性，以期建立更加優(yōu)化的方法。

1 材料和方法

1.1 受檢血清 麻風(fēng)患者血清80份，來(lái)自于廣西皮膚病研究所。據(jù)臨床表現(xiàn)、細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)和免疫學(xué)將麻風(fēng)患者分為5型：結(jié)核樣型(TT)、界限偏結(jié)核樣型(BT)、中間界限型(BB)、界線類偏瘤型(BL)和瘤型(LL)。其中前兩型稱作少菌型(PB)30例，后三型稱作多菌型(MB)50例。正常人血清80份,來(lái)自大連市體檢中心，經(jīng)檢測(cè)為正常人血清。結(jié)締組織疾病患者血清30份，銀屑病患者血清30份，妊娠血清30份，結(jié)核病患者血清30份，分別來(lái)自大連市皮膚病醫(yī)院、大連市婦產(chǎn)醫(yī)院和大連市胸科醫(yī)院。

1.2 抗原 NT-P-BSA抗原由日本奈良大學(xué)Fujiwara教授提供。用揮發(fā)性緩沖液將抗原配成濃度為0.1 ug/ml，按照每孔0.1 mL包被于96孔酶標(biāo)板(Costar公司)，37℃ 18 h干燥后置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶結(jié)合物和顯色劑 羊抗人HRP-IgM(型號(hào)D110157)，羊抗人HRP-IgG(型號(hào)D110117)購(gòu)自Sigma公司，顯色劑為鄰苯二胺(OPD)購(gòu)自Promega公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。采用吳勤學(xué)教授最適化后的NT-P-BSA-ELISA[4]。其簡(jiǎn)要程序如下：用PBS(PH7.2)浸泡抗原包被96孔板(0.2 mL/孔)，37℃孵育20 min后倒去浸泡液，甩干，加入5%封閉液(SM-PBS)0.2 mL/孔，放置于37℃孵育2 h；甩干封閉液；加待檢血清用2.5% SM-PBS稀釋，每孔加0.1 mL，置于37℃孵育1 h；甩去血清，用PBS沖洗3遍扣干；加酶結(jié)合物按1∶1000稀釋(稀釋液為2.5% SM-PBS)，每孔0.1 mL，置37℃ 1 h；甩去酶結(jié)合物，用PBS沖洗3次。加0.01%底物液(OPD 10 mg，PH 5.0檸檬酸-磷酸鹽緩沖液99 mL，甲醇1 mL，30% H2O240 μL)，每孔0.1 mL，置37℃保溫30 min；加終止液(1.25 M的H2SO4)，每孔0.1 mL，立即在酶標(biāo)儀(Bio-RAD)于波長(zhǎng)為490 nm處讀OD值。每份血清加兩個(gè)孔，取平均值，兩孔值變化超過(guò)10%重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每板均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照及空白對(duì)照，用空白對(duì)照校零點(diǎn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、t檢驗(yàn)﹑敏感性和特異性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值， P/N比值(患者平均值/正常人平均值)，折線圖。

2 結(jié)果

見(jiàn)表1。兩組實(shí)驗(yàn)血清稀釋度在1∶200時(shí)P/N值均較1∶100大，我們實(shí)驗(yàn)中選取血清的稀釋濃度為1∶200。

麻風(fēng)患者皮膚組織切刮液查菌是診斷麻風(fēng)的主要方法之一，我們將血清學(xué)結(jié)果與查菌的細(xì)菌指數(shù)(BI)進(jìn)行作圖比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 NT -IgM-ELISA和NT-IgG-ELISA在血清濃度1∶200和1∶100時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：P/N=患者血清OD平均值/正常人血清OD平均值

表2 用NT-IgM-ELISA和NT-IgG-ELISA檢測(cè)受檢對(duì)象血清抗體的結(jié)果

注：PB=少菌型患者，MB=多菌型患者，Nu=例數(shù)，NT-IgM-ELISA中t=7.98，P<0.05，NT-IgG-ELISA中t=7.56，P<0.05

表3 麻風(fēng)患者與正常人的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值

圖1 NT-P-BSA-IgM-ELISA中BI值與OD值的關(guān)系

從圖1、2可知(1)隨著細(xì)菌指數(shù)(BI)的增高，血清學(xué)檢測(cè)OD值也增高；(2)在BI為0時(shí)，OD值在0.08～0.26之間；(3)相同的BI值，不同的OD值。說(shuō)明血清學(xué)較查菌方法敏感，可以早期監(jiān)測(cè)病情變化；(4)BI在0～2之間時(shí)，圖1呈輕度上升趨勢(shì)，圖2曲線基本呈水平狀，說(shuō)明NT -IgM-ELISA較NT -IgG-ELISA敏感性稍高。

圖2 NT-P-BSA-IgG-ELISA中BI值與OD值的關(guān)系

3 討論

本次NT-P-BSA-ELISA進(jìn)一步證實(shí)麻風(fēng)患者血清中存在抗NT-P-BSA的IgM和IgG抗體，且兩抗體檢測(cè)均對(duì)診斷麻風(fēng)有意義，NT-IgM-ELISA的敏感性稍高于NT-IgG-ELISA，在多菌型麻風(fēng)患者的檢出率較少菌型麻風(fēng)患者檢出率高。較查菌方法，部分查菌陰性(BI=0)的患者血清學(xué)檢測(cè)為陽(yáng)性，提示血清學(xué)方法可早期輔助診斷麻風(fēng)。

妊娠個(gè)體，銀屑病和結(jié)核病患者的血清中檢測(cè)到了交叉抗NT-P-BSA的抗體，麻風(fēng)桿菌和結(jié)核分枝桿菌同屬于分枝桿菌屬，有共同的種屬基因片段，及多種不同的可引起機(jī)體免疫應(yīng)答的分枝桿菌脂抗原，而麻風(fēng)桿菌的抗原大約為結(jié)核桿菌的1/3[5]，這可能是產(chǎn)生交叉反應(yīng)的主要原因。至于妊娠個(gè)體的交叉，有人報(bào)道可高達(dá)10.8%(即使常規(guī)輸血者亦可高達(dá)10.6%)[6]，這可能是妊娠后機(jī)體機(jī)能的變化，產(chǎn)生某種與抗體結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，這還有待進(jìn)一步的研究。

多菌型麻風(fēng)臨床特征明顯，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陽(yáng)性率高，診斷通常不會(huì)出現(xiàn)障礙，少菌型麻風(fēng)臨床特征常不典型，皮膚切刮液查菌常為陰性，所以需要有高敏感性實(shí)驗(yàn)方法輔助診斷，以便早期發(fā)現(xiàn)，早期治療。另外麻風(fēng)是皮膚病中的超級(jí)“模仿者”，被誤診的病種較多，如銀屑病、過(guò)敏性疾病、結(jié)締組織病等[6]，需要特異性較高實(shí)驗(yàn)方法，用于鑒別診斷。

總之，NT-P-BSA-ELISA的敏感性和特異性均較高，可用于麻風(fēng)的輔助診斷，治療情況及治愈后復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)，其中NT-IgM-ELISA敏感性和特異性均較NT-IgG-ELISA高。