張敏，薛正蓮，余飛，劉艷，王洲

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖,241000)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一種天然非蛋白質(zhì)類氨基酸，具有降血糖、降血壓及抗抑郁等重要的生理功能，作為功能性食品在市場(chǎng)上具有較廣的前景[1-4]。其主要是由谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)催化L-谷氨酸形成。GABA的測(cè)定方法有很多種，比如柱前衍生化高效液相色譜法[5-7]、核磁共振波譜技術(shù)[8]、氣質(zhì)聯(lián)用法[9]、毛細(xì)管電泳法[10-11]、分光光度法[12-14]、氨基酸分析儀測(cè)定法[15]等。但以上方法大部分儀器昂貴、耗時(shí)較長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣，不適合實(shí)驗(yàn)室大批量定性定量檢測(cè)GABA。

紙層析能夠快速定性檢出各種氨基酸物質(zhì)，其中GABA常用的定性方法就是通過(guò)紙層析法直觀檢測(cè)出來(lái)，采用洗脫手段將薄層色譜上的目標(biāo)氨基酸斑點(diǎn)洗脫下來(lái)，結(jié)合分光光度計(jì)在一定波長(zhǎng)下檢測(cè)出對(duì)應(yīng)濃度的吸光度[16-17]。紙層析-分光光度法既能定性又能定量檢測(cè)出氨基酸，且檢測(cè)出的GABA是純物質(zhì)，消除了發(fā)酵液中其他物質(zhì)的干擾，大大提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性與高效性，為后續(xù)提純GABA試驗(yàn)過(guò)程奠定了基礎(chǔ)[18]。但分光光度計(jì)檢測(cè)過(guò)程相對(duì)繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，1次能檢測(cè)的樣品數(shù)有限，降低了試驗(yàn)速度與效率。酶標(biāo)儀檢測(cè)原理與分光光度計(jì)一樣，但酶標(biāo)儀能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，檢測(cè)時(shí)間少，所需樣液少，節(jié)約了大量試劑，并在一定程度上保護(hù)了環(huán)境。

目前關(guān)于紙層析-酶標(biāo)儀法測(cè)定微孔板發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量的方法還未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此本研究建立紙層析-酶標(biāo)儀法，并對(duì)影響此方法的重要因素進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)高通量選育GABA高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GABA為標(biāo)準(zhǔn)品；CuSO4·5H2O、無(wú)水乙醇、正丁醇、冰醋酸，均為分析純；茚三酮為BP級(jí)；以上試劑均購(gòu)于生工生物；水為超純水。

層析液：V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=5∶3∶2，加入12 g/L的茚三酮[19]。

洗脫液：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%乙醇∶6 g/L CuSO4·5H2O(體積比)為38∶2[19]。

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Thermo；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析；振蕩水浴鍋，天瑞儀器。

1.2 菌株

糞腸乳酸球菌(L-120-1)由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉10，葡萄糖5，吐溫-80 0.1 mL，K2HPO40.2，檸檬酸二銨0.2，MgSO40.2，MnSO40.05，CH3COONa·3H2O 5；115 ℃滅菌30 min，1 mL/96孔板，100 mL/250 mL搖瓶，100 r/min培養(yǎng)16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5，酵母浸出粉5，葡萄糖10，丁二酸鈉5，L-谷氨酸 10；115 ℃滅菌30 min，1 mL/96孔板，75 mL/250 mL搖瓶，靜置培養(yǎng)3 d。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將新華一號(hào)濾紙裁剪成所需大小，濾紙下端2 cm處輕輕畫1條直線，在線上每隔2 cm畫1個(gè)小圓圈，圈直徑不超過(guò)3 mm，用微量取樣器吸取質(zhì)量濃度為5.5 g/L標(biāo)準(zhǔn)樣液1 μL點(diǎn)在小圓圈內(nèi)，點(diǎn)樣點(diǎn)干后，將層析紙卷成桶狀固定住并垂直放進(jìn)已被層析液飽和12 h的層析缸內(nèi)，密閉層析一定時(shí)間，后取出濾紙，并用烘干槍吹干，待出現(xiàn)紫色斑點(diǎn)且斑點(diǎn)大小及形狀不變時(shí)，將斑點(diǎn)剪下并放入5 mL洗脫液中，洗脫條件：40 ℃，80 r/min，水浴洗脫30 min。使用酶標(biāo)儀在200～900 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定GABA的最大吸收峰。

1.4.2 GABA測(cè)定原理及方法

測(cè)定原理：GABA在紙層析過(guò)程中會(huì)與茚三酮反應(yīng)且經(jīng)過(guò)高溫顯色生成紫紅色斑點(diǎn)，乙醇能夠洗脫下斑點(diǎn)并與銅離子結(jié)合，生成紅色離子締合物，在一定的波長(zhǎng)下有最大吸收峰，可以測(cè)定發(fā)酵液中的GABA產(chǎn)量[19]。

紙層析-分光光度法：按照參考文獻(xiàn)[13]測(cè)定發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量。

紙層析-酶標(biāo)儀法：取1 mL的發(fā)酵液于6 000 r/min離心5 min，后取上清液在沸水中煮5 min，用微量取樣器吸取1 μL按1.4.1同樣方式處理，使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

1.4.3 測(cè)定方法中主要影響因素的優(yōu)化

分別配制質(zhì)量濃度為1、5、10 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4.2的測(cè)定方法對(duì)主要影響因素即層析液中顯色劑-茚三酮的濃度、展開劑-正丁醇與冰醋酸與水三者體積比、洗脫液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)，乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O體積比進(jìn)行優(yōu)化。其中對(duì)顯色劑-茚三酮濃度進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，茚三酮濃度值分別為4、8、12、16 g/L；展開劑-正丁醇∶冰醋酸∶水配比優(yōu)化時(shí)設(shè)為(體積比)5∶3∶2、5∶2∶3、5∶1∶4、2∶1∶1、3∶2∶1、3∶1∶2、2∶3∶1；對(duì)洗脫液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，乙醇的體積分?jǐn)?shù)值設(shè)為0、25%、50%、75%、100%；洗脫液中乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O配比優(yōu)化時(shí)設(shè)為(體積比)39∶1、38∶2、37∶3、36∶4。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確配制10 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)液，分別稀釋成1、2、3、4、5、6、7 g/L，按優(yōu)化后的方法分別使用酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線1、2。

1.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用微量取樣器吸取5 g/L GABA標(biāo)準(zhǔn)樣液1 μL按優(yōu)化后的方法進(jìn)行處理后放入5 mL洗脫液中，分別洗脫10、20、30、60、90 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

1.4.6 精密度試驗(yàn)

將質(zhì)量濃度分別為1.5 g/L和6.5 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到已知質(zhì)量濃度的發(fā)酵液中，按照優(yōu)化后的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品濃度，每組樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

將質(zhì)量濃度分別為2、3、4、5、6 g/L的GABA標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到已知質(zhì)量濃度的發(fā)酵液中，按照優(yōu)化后的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品濃度及回收率，每組樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.8 兩種方法擬合驗(yàn)證

將經(jīng)過(guò)ARTP誘變后所獲得的30株突變株進(jìn)行96孔板發(fā)酵，分別使用優(yōu)化后的紙層析-酶標(biāo)儀法和紙層析-分光光度法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量，并利用origin 9.1軟件進(jìn)行曲線擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

如圖1所示，GABA經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成的紅色離子締合物在512 nm處有最大吸收峰，故接下來(lái)的試驗(yàn)采用512 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 γ-氨基丁酸紫外可見吸收光譜

Fig.1 UV absorption spectra of GABA

2.2 測(cè)定方法中主要影響因素的優(yōu)化

分別對(duì)紙層析-酶標(biāo)儀法的主要影響因素即層析液中顯色劑-茚三酮的濃度、展開劑-正丁醇與冰醋酸與水3者體積比、洗脫液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)，乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O體積比進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如下：

2.2.1 層析液中茚三酮濃度對(duì)吸光度的影響

按1.4.2測(cè)定方法所測(cè)得的結(jié)果如圖2。如圖2所示，利用3種質(zhì)量濃度(1、5、10 g/L)的GABA進(jìn)行試驗(yàn)，均出現(xiàn)隨著層析液中茚三酮濃度的逐漸增加，GABA反應(yīng)生成的紅色離子締合物吸光度先增加后減少，且在茚三酮質(zhì)量濃度達(dá)到8 g/L時(shí)，反應(yīng)體系的吸光度達(dá)到最大的現(xiàn)象。此種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是當(dāng)茚三酮質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，GABA與茚三酮能夠更好地結(jié)合且反應(yīng)靈敏，經(jīng)過(guò)高溫顯色后生成紫紅色斑點(diǎn)效果最好，因此后續(xù)試驗(yàn)以8 g/L的茚三酮為顯色劑。

圖2 層析液中茚三酮質(zhì)量濃度對(duì)吸光度的影響

Fig.2 Effect of concentration of ninhydrin in chromatography solution on absorbance

2.2.2 層析液中展開劑配比對(duì)吸光度的影響

不同展開劑配比層析效果如表1。L-谷氨酸為生成GABA所需的底物，因此在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的L-谷氨酸，有利于GABA的生物合成[20]。但是發(fā)酵液中L-谷氨酸并未消耗完，且L-谷氨酸與GABA的極性相近，在紙層析時(shí)2者不易分開，為發(fā)酵液中產(chǎn)物GABA的分離帶來(lái)困擾，本試驗(yàn)在GABA標(biāo)準(zhǔn)品溶液中添加了5 g/L的L-谷氨酸，以獲得能夠排除這種干擾因素的展開劑配比。層析的效果如表1所示，GABA及L-谷氨酸在不同層析液中，上行速度不同，若層析液中流動(dòng)相冰醋酸占比越大，GABA與L-谷氨酸上行速度越快，2者分不開或者L-谷氨酸嚴(yán)重拖尾，導(dǎo)致與GABA重疊部分較多，影響最終測(cè)定結(jié)果，使發(fā)酵液中GABA理論值偏高。若層析液中固定相水占比越大，GABA與L-谷氨酸層析速度則越慢，可能會(huì)導(dǎo)致樣品丟失。因此選用合適配比的展開劑對(duì)試驗(yàn)至關(guān)重要，如表1所示，層析效果最好的是展開劑配比為2∶1∶1與3∶1∶2。但遷移率差值有時(shí)也可為層析效果提供參考，通常遷移率差值越大，層析效果越好[21]。由于配比為2∶1∶1展開劑中GABA與L-谷氨酸遷移率差值大于3∶1∶2，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇展開劑配比為V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=2∶1∶1。

表1 不同配比的展開劑層析效果

注：展開劑配比為V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)。

2.2.3 洗脫液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度的影響

按1.4.2測(cè)定方法所測(cè)得的結(jié)果如圖3。

圖3 洗脫液中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度的影響

Fig.3 Effect of the volume fraction of ethanol of eluent on absorbance

如圖3所示，利用3種質(zhì)量濃度(1、5、10 g/L)的GABA進(jìn)行試驗(yàn)，均出現(xiàn)隨著洗脫液中乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，GABA反應(yīng)生成的紅色離子締合物吸光度先增加后減少，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%時(shí)，反應(yīng)體系的吸光度達(dá)到最大值。這可能是由于當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為25%與50%時(shí)，洗脫液不能徹底洗脫下濾紙上的斑點(diǎn)，導(dǎo)致所測(cè)得的吸光值偏低且沒有可靠性；而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，吸光度也偏小的原因可能是GABA與茚三酮高溫顯色反應(yīng)生成的物質(zhì)進(jìn)一步與Cu2+結(jié)合需要在一定含量的水存在下進(jìn)行。因此，后續(xù)研究洗脫液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)采用75%。

2.2.4 洗脫液配比對(duì)吸光度的影響

按1.4.2測(cè)定方法所測(cè)得的結(jié)果如圖4。

圖4 洗脫液配比對(duì)吸光度的影響

Fig.4 Effect of eluent ratio on absorbance

如圖4所示，利用3種質(zhì)量濃度(1、5、10 g/L)的GABA進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)洗脫液中75%乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O的體積比為39∶1時(shí)，GABA反應(yīng)生成的紅色離子締合物吸光度達(dá)到最大，后繼續(xù)提高Cu2+濃度，吸光度卻逐漸減小。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能與CuSO4的Cu2+與茚三酮-GABA結(jié)合物的締合程度有關(guān)，Cu2+濃度越大，最終反應(yīng)體系的吸光值越小，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇75%乙醇與6 g/L CuSO4·5H2O配比為39∶1的洗脫液作為最適洗脫溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

如圖5所示，酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)測(cè)定的GABA標(biāo)準(zhǔn)品濃度在1～7 g/L之間均有較好的線性關(guān)系。其中酶標(biāo)儀所建線性方程為：y1=0.018 9x+0.009 1(R2=0.999 0)，可以利用酶標(biāo)儀-紙層析法快速檢測(cè)發(fā)酵液中GABA的含量。

圖5 酶標(biāo)儀與分光光度計(jì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.5 The standard curve was established by microplate reader and spectrophotometer

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

從表2可知，洗脫液對(duì)GABA高溫顯色形成的紫紅色斑點(diǎn)進(jìn)行洗脫，反應(yīng)10～30 min，紅色離子締合物的形成并未達(dá)到飽和，吸光度偏??；反應(yīng)30 min后，紅色離子締合物幾乎達(dá)到飽和，吸光度達(dá)到最大值。在實(shí)際過(guò)程中，檢測(cè)誘變后大量突變株經(jīng)孔板發(fā)酵后效價(jià)需要一定的操作時(shí)間，而從表2可知，GABA反應(yīng)液在30～90 min內(nèi)吸光度基本保持不變，穩(wěn)定性良好，滿足實(shí)際需求。

表2 GABA反應(yīng)液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

為了盡可能減少試驗(yàn)誤差，使得試驗(yàn)更準(zhǔn)確，必須在工業(yè)檢測(cè)中提高試驗(yàn)精密度[22]。由表3可知，各組在低濃度和高濃度的RSD均小于0.5%，表明該方法測(cè)定發(fā)酵液中GABA含量精密度高。

表3 精密度試驗(yàn)

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

為了驗(yàn)證樣品的前處理過(guò)程是否對(duì)樣品的測(cè)定產(chǎn)生影響以及測(cè)量過(guò)程中是否有基體干擾，必須進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)[23]。從表4可知，平均回收率為98.248 5%，RSD為2.625 5%。結(jié)果表明，采用酶標(biāo)儀-紙層析法測(cè)定發(fā)酵液中GABA加樣回收率較高，前處理過(guò)程及水溶液基體對(duì)樣品的測(cè)定影響幾乎可以忽略不計(jì)。

表4 加標(biāo)回收率

2.7 兩種方法擬合結(jié)果

相關(guān)強(qiáng)度由相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值決定，相關(guān)系數(shù)的正負(fù)是相關(guān)方向，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)家提出了相關(guān)性強(qiáng)度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，將R2=0.7作為一個(gè)較高的相關(guān)關(guān)系[24]。由圖7可知，擬合曲線的R2=0.939 8，表明紙層析-酶標(biāo)儀法與紙層析-分光光度法同時(shí)測(cè)定誘變后大量突變株發(fā)酵液中的GABA含量具有很好的正相關(guān)性，可以利用紙層析-酶標(biāo)儀法快速、高效地測(cè)定較多發(fā)酵樣品中GABA的含量。

a-標(biāo)峰紙層析；b-發(fā)酵液紙層析

圖6 標(biāo)樣與發(fā)酵液紙層析圖

Fig.6 Result of GABA paper chromatogram

注：圖6為部分突變株(編號(hào)為5、6、7，每組發(fā)酵液樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù))發(fā)酵液中GABA的紙層析圖，可以直觀地看出GABA斑點(diǎn)的分布以及濃度相對(duì)大小。

圖7 紙層析-酶標(biāo)儀法與紙層析-分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中GABA的相關(guān)性

Fig.7 The relationship between paper chromatography-microplate reader and paper chromatography-spectrophotometer for determination of GABA in fermentation broth

3 討論

目前文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于GABA的測(cè)定方法主要包括：(1)高效液相色譜法：廣泛用于植物如桑葉、糙米、豆豉等中GABA含量的測(cè)定，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、使用范圍廣，但耗時(shí)較長(zhǎng)，比較昂貴，適合科研中有高準(zhǔn)確度要求的測(cè)定使用；(2)氨基酸分析儀測(cè)定法：在靈敏度及多樣品處理時(shí)表現(xiàn)較好，可用于GABA產(chǎn)生菌菌種選育，但是使用這種測(cè)定方法成本昂貴，測(cè)定耗時(shí)長(zhǎng)，故在工業(yè)生產(chǎn)中使用較少；(3)分光光度法：在GABA產(chǎn)量的測(cè)定中，簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，但效率較低。酶標(biāo)儀滿足吸光物質(zhì)濃度在一定波長(zhǎng)下與吸光度成線性相關(guān)的規(guī)律，是實(shí)驗(yàn)室常用的設(shè)備[25-26]，適用于物質(zhì)的檢測(cè)定量分析，且能夠一次性快速檢測(cè)大量的樣品，在GABA高產(chǎn)菌株的選育中具有高效性。

本研究對(duì)影響紙層析-酶標(biāo)儀法的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，并利用此方法與紙層析-分光光度法同時(shí)測(cè)定誘變后多批突變株發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量且進(jìn)行了曲線擬合，結(jié)果表明2種方法測(cè)定GABA含量線性關(guān)系良好，紙層析-酶標(biāo)儀法能快速、準(zhǔn)確地測(cè)定微孔板發(fā)酵液中GABA產(chǎn)量，為后續(xù)高通量選育GABA高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。