焦夢悅,高 涵,王偉娜,田益玲

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

淀粉主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。直鏈淀粉是具有(1-4)-α-D-葡聚糖鍵的非分支化或輕分支化線性分子,支鏈淀粉是具有α-(1,6)糖苷鍵的高度支化聚集分子。直鏈淀粉、支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)及支直比與淀粉的物理性質(zhì)、熱特性密切相關(guān),如糊化[1-4]。支直比也影響淀粉食品的老化的一個(gè)主要問題[5]?？傊?直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量以及支直比對淀粉的功能和營養(yǎng)特性有顯著的影響。

近年來發(fā)展起來的對于測定支直淀粉含量的方法精確度較高,有近紅外光譜分析法[6-8]、自動(dòng)分析檢測法[9-10]、伴刀豆球蛋白法及排阻色譜分析法[11-12]。然而,因其操作復(fù)雜、儀器及試劑價(jià)格高而難于推廣應(yīng)用[13]。目前,在國內(nèi)應(yīng)用的碘親和力滴定法與碘比色法,但碘親和力滴定法用來確定直鏈淀粉含量。碘比色法中的單波長法目前應(yīng)用于測定谷物中直鏈淀粉含量,而雙波長法消除了直支鏈淀粉吸收峰重疊帶來的干擾,可同時(shí)測定直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量三個(gè)指標(biāo)[13]。但目前尚未有對于標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與單雙波長應(yīng)用結(jié)合的幾種方法比較。

本試驗(yàn)主要針對碘比色法中的單雙波長的應(yīng)用結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法的不同,建立四種測定淀粉中直鏈支鏈淀粉及總淀粉含量的方法。用藜麥淀粉對此方法進(jìn)行評(píng)估,最后通過測定常見淀粉考察其是否具有普適性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

直鏈淀粉(A0512)、支鏈淀粉(A8515) 標(biāo)準(zhǔn)品(土豆來源),Sigma公司;碘 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;碘化鉀 西隴科學(xué)股份有限公司;氫氧化鉀 天津市大茂化學(xué)試劑廠;藜麥(白藜) 山西省靜禾縣雙路鄉(xiāng)藜麥種植合作社;馬鈴薯、木薯、玉米、小麥 上海裕田農(nóng)業(yè)科技有限公司;水磨糯米粉 廣州舒可曼有限公司;大米(粳米) 北京七河源食品科技有限公司。

JJ224BC型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;1512PHS-3CpH計(jì) 上海三信儀表廠;UV-1700PC紫外可見分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉樣品的制備及直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 參照文獻(xiàn)[14],從藜麥、馬鈴薯、木薯、玉米、小麥中提取淀粉。按參考文獻(xiàn)[15]分別配制2 mg/mL的直鏈淀粉、支鏈標(biāo)準(zhǔn)工作液,待用。

直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液的配制:分別取直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL于50 mL容量瓶,加蒸餾水25 mL,以0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至3.5,加入0.5 mL碘試劑,配制成濃度范圍為:8～80 μg/mL的工作曲線。20 ℃靜置30 min后搖勻,待用。

支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液的配制:分別取支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 mL于50 mL容量瓶,加蒸餾水25 mL,以0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至3.5,加入0.5 mL碘試劑,配制成濃度范圍為:80～260 μg/mL的工作曲線。20 ℃靜置30 min后搖勻,待用。

混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制:分別取直鏈和支鏈淀粉工作液按照表1配制混合標(biāo)準(zhǔn)液[2],加蒸餾水25 mL,以0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH至3.5,加入0.5 mL碘試劑,待用。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)液的制備Table 1 Mixed standard curve preparation

1.2.2 淀粉的四種測定方法 以蒸餾水為空白對碘溶液、40 μg/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液、80 μg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液掃描液進(jìn)行全波長掃描;以碘溶液為空白對照對40 μg/mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液、80 μg/mL支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液掃描液進(jìn)行全波長掃描，確定空白校正液。再分別對40 μg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液、80 μg/mL支鏈標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行全波長掃描,確定直鏈淀粉測量波長及參比波長;支鏈淀粉測量波長及參比波長。分別將1.2.1中的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液分別按表2中方法1、2所示波長進(jìn)行測定,將1.2.1中的混合標(biāo)準(zhǔn)液按表2中方法3、4所示波長進(jìn)行測定。

表2 四種方法測定波長Table 2 Determination of wavelength of four methods

方法1、2以淀粉濃度為橫坐標(biāo)；直鏈淀粉、支鏈淀粉測定吸光度值為縱坐標(biāo),繪制方法1標(biāo)準(zhǔn)曲線;以直鏈淀粉、支鏈淀粉測定吸光度差值為縱坐標(biāo),繪制方法2標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法3、4以淀粉在混合標(biāo)準(zhǔn)液中的百分比為橫坐標(biāo)；以直鏈淀粉、支鏈淀粉測定吸光度值為縱坐標(biāo),繪制方法3標(biāo)準(zhǔn)曲線;以直鏈淀粉、支鏈淀粉測定吸光度差值為縱坐標(biāo),繪制方法4標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 分別取直鏈淀粉工作液、支鏈淀粉工作液按表3配成檢驗(yàn)液,加入25 mL蒸餾水,按1.2.2方法測定,代入標(biāo)曲中得到淀粉含量測定值并與實(shí)際含量進(jìn)行比較。

表3 驗(yàn)證液制備Table 3 Preparation of validation solution

1.2.4 精密度試驗(yàn) 精密稱取藜麥淀粉樣品0.1000 g,料液比1∶10 g/mL石油醚脫脂8 h后,用1.2.2中四種方法分別進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.5 樣品回收率試驗(yàn) 回收率測定試驗(yàn)是驗(yàn)證測定方法準(zhǔn)確度的有效方法之一。向2 mg/mL藜麥淀粉溶液分別添加準(zhǔn)確量取的直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液[16],按表4配制回收率測定液,加入25 mL蒸餾水,測定,求其回收率。

表4 回收率測定液制備Table 4 Preparation of recovery solution

1.2.6 直鏈淀粉、支鏈淀粉含量的測定 用1.2.2方法分別測定及計(jì)算馬鈴薯、木薯、小麥、玉米、赤豆、小米、大米、糯米淀粉。代入方法可得支鏈淀粉、直鏈淀粉含量。代入以下公式求得支直比。

支直比(%)=支鏈淀粉含量×100/直鏈淀粉含量

式中：支鏈、直鏈淀粉含量單位為mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件作圖,樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),最后結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 直鏈/支鏈淀粉掃描圖

如圖1所示,以蒸餾水或碘溶液為空白對淀粉-碘復(fù)合物的掃描圖。對比可得,以蒸餾水為空白時(shí),對直鏈、支鏈淀粉-碘復(fù)合物掃描250～420 nm之間吸收峰為碘溶液吸收峰;以碘溶液為空白時(shí)鏈淀粉掃描圖在536 nm處有更明顯的峰,方便等吸光度作圖法進(jìn)行分析。直鏈淀粉在638 nm處也有明顯的峰。因此選擇碘溶液作空白。

圖1 全波長掃描空白校正選擇Fig.1 Selection of full wavelength scanning blank correction

參比波長的差別在于標(biāo)準(zhǔn)品的差異及等吸收點(diǎn)作圖點(diǎn)選取的差異。用UV-分光光度計(jì)對直鏈/支鏈淀粉掃描液進(jìn)行全波長掃描得吸收光譜。由圖2可知,根據(jù)雙波長等吸光度點(diǎn)作圖法確定直鏈淀粉的測量波長638 nm,參比波長430 nm;支鏈淀粉的測量波長536 nm,參比波長為768 nm。此結(jié)果與劉襄河等[17]確定的直鏈淀粉的測量波長630 nm,參比波長480 nm;支鏈淀粉的測量波長550 nm,參比波長為735 nm相接近。

圖2 直鏈/支鏈淀粉波長選擇Fig.2 Wavelength selection of amylose and amylopectin

2.2 四種方法測定直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸系數(shù)比較

在上述確定的波長下,按照方法1.2.2的方法做相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如表5所示。從表5可知,四種方法測定直鏈和支鏈淀粉工作曲線的決定系數(shù)都較高,只有方法4測定支鏈淀粉的決定系數(shù)較差。因此對于直鏈淀粉的測定可以選用這四種方法的任何一種,在沒有其他干擾的情況下準(zhǔn)確性還是比較高的,而支鏈淀粉選用前三種方法更好一些。

表5 直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線及決定系數(shù)Table 5 Standard curve and determination coefficient of amylose and amylopectin

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定方法的可靠性,按照實(shí)驗(yàn)方法的1.2.3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3所示:

由圖3可知,直鏈淀粉含量測定中,四種方法差異不顯著,都適用于直鏈淀粉含量測定。直鏈淀粉含量低時(shí),方法1測定值與實(shí)際值最接近,但隨著含量的增加,差值越來越大,而其他三種方法較為精確。對于支鏈淀粉,方法1與方法2、3、4差異顯著(p<0.05)。方法1偏差大,無法代表實(shí)際值,由圖4中方法2與實(shí)際值高度變化趨勢可知,方法2所得在支鏈淀粉比例變小時(shí)偏差變大,不能應(yīng)用于淀粉中直鏈/支鏈的比例測定。這是因?yàn)閷?shí)際樣品中一般都含有直鏈淀粉,直鏈淀粉在該波長下的吸光度值會(huì)影響測定結(jié)果。方法4所得數(shù)值與實(shí)際值偏差較大,方法3測定值更接近于實(shí)際值。綜合比較可得,方法3更適用于測定淀粉樣品中支鏈淀粉含量。

2.4 精密度測試

在本實(shí)驗(yàn)條件下,由表6可知,測定直鏈淀粉四種方法的5次實(shí)驗(yàn)值之間的一致性良好,藜麥淀粉的直鏈淀粉的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2%,說明采取這四種方法測定淀粉樣品中的直鏈淀粉含量具有較高的精度?？傻脺y定直鏈淀粉四種方法均一致性良好。

表6 直鏈淀粉精密度(%)Table 6 Amylose precision test(%)

但經(jīng)過支鏈淀粉驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)方法1無法表示實(shí)際值，之后不再討論方法1。由表7可知,測定支鏈淀粉的方法3相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于2%,方法2、4相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD小于5%,較方法3一致性稍差。

表7 支鏈淀粉精密度(%)Table 7 Amylopectin precision test(%)

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

直鏈淀粉回收率測定試驗(yàn)結(jié)果如表8所示,無論檢驗(yàn)液中是否有加入干擾的支鏈淀粉,方法2、4的回收率都在100.16%～103.48%,方法1、3的回收率在114.44%～152.72%,RSD均<1%,說明方法2、4分析方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,方法1、3分析方法準(zhǔn)確度較差,說明方法2、4適合測定試驗(yàn)原料中的直鏈淀粉。

表8 直鏈淀粉各標(biāo)準(zhǔn)曲線回收率檢驗(yàn)Table 8 Standard curve recovery test of amylose

支鏈淀粉回收率測定試驗(yàn)結(jié)果如表9所示,在沒有加入干擾的直鏈淀粉工作液情況下,回收率在94.85%～111.58%,RSD均<2%,說明分析方法在無干擾下具有較高的準(zhǔn)確度和精密度?；厥章试浇咏?00%,說明結(jié)果越好。而在加入干擾的直鏈淀粉工作液情況下,方法2、4所得測定值的回收率125.30%、139.90%與100%差值變大,表明誤差增大,這種誤差增大的情況可能與直鏈淀粉所占比例有關(guān),藜麥淀粉中直鏈淀粉所占比例小,因加入直鏈淀粉工作液,直鏈淀粉比例的增大,誤差增大,表明方法2、4并不適合測定試驗(yàn)原料中的支鏈淀粉含量。表9中樣品2方法3的回收率為94.52%,RSD<0.5%,說明該分析方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度,適合測定試驗(yàn)原料中的支鏈淀粉。

表9 支鏈淀粉各標(biāo)準(zhǔn)曲線回收率Table 9 Standard curve recovery test of amylopectin

2.6 樣品測定

如表10，測定直鏈淀粉方法中,兩種方法測定結(jié)果相似,進(jìn)行顯著性分析顯示兩種方法無差異。測定支鏈淀粉方法中,方法3、4差異顯著(p<0.05),方法2與方法3、4差異不顯著,方法2、4測定結(jié)果誤差大,對應(yīng)前面回收率實(shí)驗(yàn),可能是雙波長方法受直鏈淀粉含量影響太大,導(dǎo)致結(jié)果大;淀粉品種間的差異也會(huì)影響測定結(jié)果。對比可知,方法3更適用于支鏈淀粉含量的測定。因支鏈淀粉測定中方法3使用混標(biāo),對應(yīng)直鏈淀粉測定中同樣使用混標(biāo)的方法4,因此結(jié)合可方便、快捷測出其各個(gè)含量。

表10 樣品測定結(jié)果Table 10 Results of sample determination

表10中藜麥淀粉中的直鏈淀粉含量為6.00%～7.00%,與以往研究使用Con A沉淀法測定真直鏈淀粉含量(8.22%～9.30%)的研究大致相當(dāng)[18-19]。Watanabe等[20]采用凝膠滲透色譜法(GPC)測定直鏈淀粉含量,藜麥淀粉含量在5.2%～10.9%之間,與本文結(jié)果接近。表中數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道相近品種或產(chǎn)地的馬鈴薯(24.97%～44.41%)[21]、木薯(15.52%～21.53%)[22]、小麥(31.4%)[23]、玉米(23%～50%)[24]、赤豆(35.43%)[25]、小米(26.29%～31.31%)[26]、大米(17.3%～18.3%)[27]、糯米淀粉直鏈淀粉占總淀粉比例的結(jié)果相近。

2.7 各淀粉總淀粉含量及支直比

表11表示了直鏈淀粉方法4結(jié)合支鏈淀粉方法3測定值所得常見谷物淀粉和藜麥淀粉中總淀粉含量以及支鏈淀粉與直鏈淀粉的比值。總淀粉含量為分別測得的直鏈淀粉含量與支鏈淀粉含量總和。因提純后樣品仍存在雜質(zhì),所以將分別測定的直鏈、支鏈淀粉含量數(shù)值相加得出總淀粉含量更準(zhǔn)確合理,且排除了雜質(zhì)的干擾。此方法適用于總淀粉含量的測定。此方法還可計(jì)算支直比,支直比反映谷物淀粉組成,支鏈淀粉比例含量高,將更容易受到淀粉酶的影響,表11中糯米、藜麥支直比相對更高,表明其對淀粉酶的敏感性高。支直比影響淀粉的功能特性,如糊化特性、對酶的敏感性及回生特性等,為淀粉研究提供參考價(jià)值。

表11 各淀粉總淀粉含量及支直比Table 11 Total starch content and ratio of starch to amylose

3 結(jié)論

通過對單、混標(biāo)與單、雙波長測定方法組合的四種方法從驗(yàn)證、回收率、精密度及實(shí)際樣品測定結(jié)果分析,單獨(dú)測定直鏈淀粉采用方法2、4較精確;單獨(dú)測定支鏈淀粉,雙波長的方法,即方法2、4不適合。而同時(shí)測定兩種淀粉則是采用方法3、4進(jìn)行結(jié)合更為準(zhǔn)確?？偨Y(jié)得到的具體方案為:測定加入碘試劑淀粉溶液638、536、430 nm處吸光度,代入以混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制作的,A638-A430、A536與淀粉濃度得到的回歸方程,能求出支、直淀粉含量、總淀粉含量及支直比。此方法進(jìn)一步排除了雙波長法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程中兩種淀粉標(biāo)準(zhǔn)品的互相干擾,可同時(shí)測定兩者含量。未來需探明谷物的特性并與淀粉組成結(jié)合起來分析以得出更系統(tǒng)的結(jié)論。