周亭屹,高新昌,黨亞麗,*,潘道東,曹錦軒

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,保健食品研究所,浙江杭州 310013; 2.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315800)

生物信息學(xué)(bioinformatics)技術(shù)是一種綜合運(yùn)用生物學(xué)、信息科學(xué)的各種知識(shí)和工具,對(duì)復(fù)雜的生物數(shù)據(jù)進(jìn)行獲取、處理、存儲(chǔ)、分發(fā)、分析和解釋,從而得到我們能夠理解和接受的各種知識(shí)[1]。此技術(shù)于二十世紀(jì)七八十年代提出,結(jié)合計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物學(xué)、數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)技術(shù)分析和解釋生物數(shù)據(jù),近年來發(fā)展迅速的生物信息學(xué)可為生物大數(shù)據(jù)分析提供方法和軟件工具,目前已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等領(lǐng)域,用于解釋疾病的生物學(xué)機(jī)制[2]。

生物活性肽是一類對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物,由20種天然氨基酸按照不同的排列方式組成,一般長度在2～30個(gè)氨基酸之間。由于構(gòu)成肽的氨基酸種類、數(shù)目與排列順序不同,生物活性肽具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)與功能,包括增強(qiáng)免疫、降血糖、降血壓、抗菌、抗病毒、抗疲勞和降血脂等[3-9],同時(shí)由于其食用安全性極高,是當(dāng)前國際食品界最熱門的研究課題之一[10]。由于經(jīng)典的生物活性肽的分離鑒定方法仍然存在許多限制,生物信息學(xué)技術(shù)被迅速用于生物活性肽的研究[11]。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展對(duì)發(fā)現(xiàn)和鑒定新的生物活性肽提供了很大的幫助,如將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物用酶特異性消化為肽后,通過膜過濾、色譜過濾等逐級(jí)純化可得到生物活性肽,其中多維色譜純化手段的應(yīng)用顯著提高了活性肽的純化效率。由于分析化學(xué)的進(jìn)步與創(chuàng)新,高分辨率質(zhì)譜技術(shù)可對(duì)極其復(fù)雜的混合物進(jìn)行分析,在低濃度條件下可檢出不同類型的化合物。

生物質(zhì)譜中的液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜以及四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜,開始逐漸應(yīng)用于生物活性肽的結(jié)構(gòu)分析,并輔以質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析軟件protein pilot,極大地縮短了活性肽結(jié)構(gòu)表征的周期[12]。研究者們因此獲得了大量的活性肽數(shù)據(jù),目前BIOPEP數(shù)據(jù)庫中已收錄了3600多種生物活性肽。通過生物信息學(xué)技術(shù)可獲得肽的結(jié)構(gòu)與其活性的關(guān)系,適用于活性肽的快速高通量篩選。本文綜述了幾種基于生物信息學(xué)技術(shù)尋找活性肽的方法及其應(yīng)用的最新進(jìn)展情況。

1 傳統(tǒng)的生物活性肽分離、純化和鑒定方法

傳統(tǒng)的生物活性肽研究通常包括酶解、膜分離、凝膠、尺寸排阻、離子交換、親和層析和反相液相等多級(jí)色譜方法進(jìn)行分離和純化,分離組分進(jìn)行體內(nèi)或體外的活性逐級(jí)測定,通過Edman降解或質(zhì)譜法鑒定肽序列[13],并采用定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)等方法推斷其構(gòu)效關(guān)系(表1)。近年來,基于質(zhì)譜方法的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn),為發(fā)現(xiàn)和鑒定生物活性肽提供了更加高效的方法,將酶解后的肽采用高效液相色譜和MALDI-TOF MS、CE-TOF MS和UPLC-Q/TOF MS等質(zhì)譜(MS)鑒定其序列[14-16],再通過化學(xué)合成的肽驗(yàn)證其生物活性。由于蛋白酶解物復(fù)雜,含有數(shù)千條肽段且多條肽段分子量相近或電荷數(shù)相同,該法也面臨難以分離純化、鑒定出的肽活性低甚至沒有活性等問題。因逐級(jí)純化過程選取活性較高的組分進(jìn)行純化,可能會(huì)將一些活性高的肽遺漏。此外,多種活性評(píng)價(jià)體外實(shí)驗(yàn)篩選方法尚不統(tǒng)一,且體外實(shí)驗(yàn)與生物體內(nèi)結(jié)果不一致。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行活性篩選較體外實(shí)驗(yàn)更為準(zhǔn)確,但由于其成本高,此法對(duì)于大量的分離組分并不適用。因此,如何快速高效的獲得生物活性肽仍是目前活性肽研究的難點(diǎn)。

2 基于現(xiàn)有生物信息學(xué)工具的活性肽研究

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展,文獻(xiàn)中大量的肽信息被整合到數(shù)據(jù)庫中。目前已有許多生物活性肽數(shù)據(jù)庫,如表2所示,可對(duì)活性肽進(jìn)行理論預(yù)測和模擬,主要可以在以下方面發(fā)揮作用[13]:分析活性肽的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系;計(jì)算機(jī)輔助肽結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì);預(yù)測肽的生物活性;在肽序列之間搜索和多重比對(duì);模擬蛋白水解;尋找生物活性肽的潛在前體蛋白;蛋白質(zhì)-活性肽分子對(duì)接。下文將主要介紹現(xiàn)有生物信息學(xué)工具在計(jì)算機(jī)模擬酶解、酶解產(chǎn)物的活性預(yù)測與前體蛋白的選擇、肽的生物活性預(yù)測等方面的應(yīng)用情況。

表2 常用的活性肽生物信息學(xué)工具Table 2 Bioinformatics tools used in bioactive peptides

2.1 計(jì)算機(jī)模擬酶解

蛋白質(zhì)水解是獲得生物活性肽的常見方法。水解酶的種類、濃度,加工條件及水解度等因素會(huì)影響酶水解產(chǎn)物和多肽的生物活性,同一蛋白質(zhì)經(jīng)過不同條件處理可產(chǎn)生功能不同的多肽[27]。為了選擇合適的酶和蛋白質(zhì)底物,傳統(tǒng)方法必須進(jìn)行多組平行實(shí)驗(yàn),對(duì)不同的酶種類、用量及反應(yīng)條件等因素進(jìn)行篩選,從而得到活性最強(qiáng)的水解產(chǎn)物,而通過計(jì)算機(jī)模擬酶解可大大提高這一步的實(shí)驗(yàn)效率。

首先通過ExPASy,NCBI Protein database和UniProtKB等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索出原料蛋白的氨基酸序列。在獲得蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,用一些在線工具可實(shí)現(xiàn)虛擬酶解。BIOPEP的“酶作用”模塊和ExPASy-PeptideCutter是常用的虛擬酶解數(shù)據(jù)庫,可基于不同種類酶的特異性切割位點(diǎn),預(yù)測從特定蛋白質(zhì)水解的氨基酸和肽。此外,使用虛擬酶解結(jié)合現(xiàn)有的生物活性肽數(shù)據(jù)庫,如BIOPEP,可對(duì)虛擬酶解的產(chǎn)物進(jìn)行分析:虛擬酶解產(chǎn)物中包含的已有文獻(xiàn)報(bào)道的活性肽的數(shù)量[26-28];計(jì)算蛋白質(zhì)鏈中生物活性肽的發(fā)生頻率[29];預(yù)測蛋白質(zhì)的潛在生物活性[30]。通過這些分析,可大規(guī)模篩選富含蛋白的水解原料。

計(jì)算機(jī)模擬酶解可極大提高活性肽篩選效率,但往往計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)際情況并不完全相符,究其原因可能如下:酶活性及純度影響體外水解;計(jì)算機(jī)方法模擬的水解條件,如pH、溫度、水解時(shí)間和酶-底物比例等與實(shí)際情況不一致;計(jì)算機(jī)模擬水解中酶將水解所有酶切位點(diǎn)的肽鍵;實(shí)際情況中蛋白質(zhì)經(jīng)過翻譯、糖基化等修飾后可能導(dǎo)致酶切位點(diǎn)被保護(hù),而計(jì)算機(jī)模擬消化過程中不考慮此問題;蛋白質(zhì)的預(yù)處理也會(huì)影響水解產(chǎn)物的生成;計(jì)算機(jī)模擬消化工具不能用于未知蛋白的樣品和未知切割位點(diǎn)的酶?？傊?計(jì)算機(jī)模擬水解是一種有效和低成本的提供理論水解產(chǎn)物的方法,但其最終結(jié)果尚需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 酶解產(chǎn)物的活性預(yù)測與前體蛋白的選擇

蛋白質(zhì)單酶水解可產(chǎn)生多種生物活性肽,如二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制肽,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽,抗血栓肽,抗炎肽和免疫調(diào)節(jié)肽[31-33]。Rani等[34]用BIOPEP數(shù)據(jù)庫比較了胃蛋白酶或胰凝乳蛋白酶A消化山羊乳蛋白形成ACE抑制肽的數(shù)量。結(jié)果表明,胃蛋白酶更適于產(chǎn)生ACE抑制肽。Lafarga等[35]用肽數(shù)據(jù)庫和軟件評(píng)估牛肉和豬肉蛋白質(zhì)中潛在的具有DPP-IV和ACE抑制活性的肽,并通過化學(xué)合成驗(yàn)證了肽的體外活性。Dziuba等[36]通過模擬28種酶水解乳蛋白產(chǎn)生的肽,篩選得到了具有潛在抗菌活性的新型乳蛋白衍生肽。Tulipano等[37]運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬方法預(yù)測了β-乳球蛋白和α-乳清蛋白在胃腸道消化期間產(chǎn)生的DPP-IV抑制肽。

生物信息學(xué)技術(shù)不僅可模擬單酶水解,還可預(yù)測復(fù)合酶共同作用產(chǎn)生的水解產(chǎn)物。Majumder等[38]的實(shí)驗(yàn)表明,與胃蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶單酶水解與嗜熱菌蛋白酶和胃蛋白酶復(fù)合酶水解卵轉(zhuǎn)鐵蛋白相比,復(fù)合酶水解產(chǎn)物的ACE抑制IC50值(198.0±1.21 Ug/mL)較低。Gu等[39]用ExPASy-PeptideCutter計(jì)算嗜熱菌蛋白酶單酶和嗜熱菌蛋白酶+胃蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶+胃蛋白酶+胰蛋白酶復(fù)合酶消化15種常見食物蛋白質(zhì),結(jié)合QSAR模型預(yù)測消化肽的ACE抑制活性,結(jié)果表明豬、牛肉和雞肉中的ACE抑制肽含量最高,其次是雞蛋,大豆和油菜籽,而魚類(鮭魚除外)和谷物(燕麥和大麥)ACE抑制肽含量最低。

此外,由于胃腸道中的酶可能會(huì)將活性肽降解為無活性的肽段,活性肽能否在生物體內(nèi)發(fā)揮作用取決于胃腸道消化后能否保持活性。通?？蛇x擇胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等模擬酶解,然后用Peptide Cutter和BIOPEP等數(shù)據(jù)庫預(yù)測其產(chǎn)物活性[40]。

2.3 肽的生物活性預(yù)測

肽的結(jié)構(gòu)特征,如肽鏈長度、氨基酸組成等和肽的物化特征,如氨基酸殘基的疏水性,分子電荷和側(cè)鏈等都會(huì)影響其生物活性[41]。目前開發(fā)的在線軟件Peptide Ranker、QSAR建模和分子對(duì)接等,可基于此理論預(yù)測肽的活性。

2.3.1 基于Peptide Ranker 的活性肽預(yù)測 Peptide Ranker是一種基于新型神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測生物活性肽的服務(wù)器[42]。用戶將肽序列輸入到網(wǎng)站的文本框,服務(wù)器即可將預(yù)測出的肽具有生物活性的概率給用戶,然后按照每種肽的預(yù)測生物活性概率大小進(jìn)行排序,對(duì)大量未報(bào)道過生物活性的肽是一種有效的篩選方法。但要注意的是,服務(wù)器預(yù)測的是肽具有生物活性的可能性,而不是預(yù)測肽可能具有生物活性的程度。

2.3.2 定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)建模 肽的生物活性還取決于其空間結(jié)構(gòu),因此,可根據(jù)其空間結(jié)構(gòu)預(yù)測肽活性。QSAR建模,是用數(shù)學(xué)模型定量描述分子結(jié)構(gòu)和分子的某種生物活性之間的關(guān)系。得到這種關(guān)系的數(shù)學(xué)表達(dá)式后,可用于估計(jì)肽的活性并預(yù)測高活性的肽結(jié)構(gòu),其基本原理是,一組相似化合物以同樣的方式作用于同一靶點(diǎn),則其生物活性取決于每個(gè)化合物周圍分子場的差別,這種分子場可說明分子和靶點(diǎn)之間的相互作用。目前生物活性肽QSAR建模已被應(yīng)用于抗菌肽,ACE抑制肽,抗氧化肽和DPP-IV抑制肽等[43]。Jing等[44]構(gòu)建了具有良好預(yù)測能力的ACE抑制肽QSAR模型,篩選出了4種牛奶ACE抑制三肽,并在體外驗(yàn)證了其生物活性。但由于QSAR建模方法需建立結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系的模型,在大部分活性肽功能研究中很難實(shí)現(xiàn),特別是數(shù)據(jù)庫中較稀有的活性肽。因此,大多研究都集中在ACE抑制肽、抗菌肽及一些苦味肽[45]。

2.3.3 分子對(duì)接 分子對(duì)接已被用于尋找能夠與靶蛋白相互作用的多肽[46]。此技術(shù)可實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)模擬多肽和受體分子相互作用的過程,得到直觀的結(jié)合力得分,從而篩選生物活性肽。目前,分子對(duì)接已被廣泛用于生物活性肽的篩選并說明其生物學(xué)機(jī)制,如從牛奶[32]、蠶蛹[47]和米糠[48]中篩選ACE抑制肽;從莧菜籽蛋白[49]篩選DPP-IV抑制肽;從牛奶中篩選抗血栓形成肽[50]。目前用于對(duì)接計(jì)算的軟件主要有AutoDock、DOCK、Gold、SYBYL等。分子對(duì)接已被廣泛用于生物活性物質(zhì)設(shè)計(jì),但在實(shí)際應(yīng)用中,由于長肽的柔性較大,軟件計(jì)算精度不足,其應(yīng)用主要集中在2～6肽的設(shè)計(jì)和模擬,需克服一些理論和計(jì)算等難點(diǎn),以提高預(yù)測的準(zhǔn)確性[51]。PDB數(shù)據(jù)庫中已有許多受體蛋白的信息,但受體的詳細(xì)信息和3D結(jié)構(gòu)缺乏仍是制約分子對(duì)接應(yīng)用的重要因素。此外,Nongonierma等[52]研究發(fā)現(xiàn)三肽與DPP-IV活性位點(diǎn)結(jié)合能力與其體外抑制特性沒有直接關(guān)系,多肽可能與受體產(chǎn)生非特異性的相互作用,單獨(dú)使用分子對(duì)接模擬確定有活性的多肽序列不大準(zhǔn)確。因此,分子對(duì)接的結(jié)果往往也需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3 尋找活性肽的其它生物信息學(xué)方法

3.1 根據(jù)氨基酸組成和偏好發(fā)現(xiàn)新的生物活性肽

生物活性肽通常由于其結(jié)構(gòu)和氨基酸組成而發(fā)揮給定的功能?；陔臄?shù)據(jù)庫中已知功能的肽某些位置的氨基酸偏好建立氨基酸模式,可預(yù)測出具有相似功能的肽。Wu等[53]根據(jù)已報(bào)道的活性肽,研究ACE抑制肽的定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。用偏最小二乘回歸的計(jì)算方法發(fā)現(xiàn),攜帶ACE抑制功能的二肽具有龐大側(cè)鏈以及疏水側(cè)鏈的殘基。對(duì)于三肽,羧基末端最有利的殘基是芳香族氨基酸,中間位置優(yōu)選帶正電荷的氨基酸,而氨基末端優(yōu)選疏水性氨基酸。根據(jù)這種模式,他們分析了豌豆、牛奶和大豆蛋白,并預(yù)測了7種可能具有ACE抑制作用的3種二肽和4種三肽。

此方式僅憑氨基酸序列對(duì)活性肽進(jìn)行預(yù)測,比較簡單直觀,但其并非針對(duì)肽的作用機(jī)制,且考慮的因素較少,因此可得到的活性肽序列較少,目前難以得出具有普適性的結(jié)論。

3.2 通過分析蛋白質(zhì)相互作用結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)新的生物活性肽

對(duì)蛋白激酶C(PKC)進(jìn)行的研究已證明,通過分析蛋白質(zhì)之間相互作用的區(qū)域?qū)ふ一钚噪囊彩且环N可行的方式。PKC是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,其參與許多信號(hào)傳導(dǎo)事件,這些酶與癌癥、糖尿病、心臟病發(fā)作、中風(fēng)和心力衰竭等許多疾病有關(guān)。因此,有許多關(guān)于PKC同工酶抑制劑的研究。Dempsey等[54]觀察已報(bào)道的兩個(gè)可抑制PKC的蛋白14-3-3和膜聯(lián)蛋白I,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)蛋白質(zhì)共有一個(gè)含12個(gè)氨基酸的序列。他們推斷這兩種不相關(guān)的蛋白質(zhì)共享該區(qū)域,且兩者都與PKC結(jié)合,因此該區(qū)域可能是介導(dǎo)兩種蛋白質(zhì)與PKC結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。通過研究這種12肽和PKC的相互作用,結(jié)果顯示它可阻止PKC與其底物結(jié)合,從而抑制其下游的生理反應(yīng)。

此方法可通過對(duì)已有的數(shù)據(jù)庫分析,以及計(jì)算機(jī)模擬比對(duì),尋找與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的不相關(guān)蛋白質(zhì)共享的區(qū)域,從而發(fā)現(xiàn)新的活性肽段。

4 展望

生物活性肽具有低毒、低致敏性、高安全性等優(yōu)點(diǎn),在保健與預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景。目前生物活性肽的來源物種及地域分布范圍都在逐漸擴(kuò)大,篩選難度隨之增加。生物信息學(xué)技術(shù)已廣泛用于提供活性肽的構(gòu)象信息,預(yù)測活性,構(gòu)效關(guān)系描述并預(yù)測高活性結(jié)構(gòu)?；谏镄畔W(xué)技術(shù)的生物活性肽研究方法已打破了傳統(tǒng)研究方法的局限性,大大縮短了研究費(fèi)用和時(shí)間。然而,這種方法仍存在一些局限性,如缺乏對(duì)模擬酶水解中蛋白質(zhì)修飾情況及其對(duì)酶水解影響的研究;由于生物體消化吸收過程十分復(fù)雜,體外模擬胃腸消化和實(shí)際情況有差距;缺乏分子對(duì)接受體的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息和3D結(jié)構(gòu)。此外,生物信息學(xué)的預(yù)測能力,蛋白質(zhì)組學(xué)的準(zhǔn)確性以及計(jì)算機(jī)模擬和生物體內(nèi)之間的差距尚需進(jìn)一步研究。此外,目前的數(shù)據(jù)分析主要基于有活性的肽,而缺少對(duì)無活性的陰性數(shù)據(jù)的分析。因此,還需要開發(fā)更強(qiáng)大準(zhǔn)確的生物信息學(xué)技術(shù)工具,以便于進(jìn)一步分析、處理和解釋獲得的數(shù)據(jù)。

目前部分乳源的活性肽已用于功能性食品的開發(fā)[55],但大部分活性肽研究仍停留在體外活性研究階段,體內(nèi)數(shù)據(jù)及臨床證據(jù)缺乏,建議結(jié)合快速簡便的體外篩選方法和體內(nèi)研究驗(yàn)證其活性。此類肽在胃腸道中的消化、吸收和進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)的量,肽在生物體內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)化以及排泄相關(guān)的研究仍需進(jìn)行深入研究。因此,未來還應(yīng)著重研究已確定的活性肽的穩(wěn)定性、生物利用度和生物分布等,以確保能作為功效因子成功用于改善人們健康。