李雨鑫,盛 瑜,杜培革,安麗萍,楊瑩瑩,郭長春,王佳琪

(北華大學藥學院,吉林吉林 132013)

姬松茸(AgaricusblazeiMurill,ABM),又稱巴西蘑菇、小松菇、柏氏蘑菇,是一種可栽培的名貴食用真菌[1]。姬松茸含有多糖、甾醇類物質、核酸、脂質、外源凝集素、維生素等活性物質[2]。其中姬松茸多糖(Agaricusblazeipolysaccharide,ABP)是其主要活性成分之一,具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降低血糖、降低膽固醇、抗炎等功效,具有較高的藥用價值[3-4]。據報道,D-半乳糖(D-gal)可引發(fā)擬衰老反應,導致免疫功能下降,對氧自由基代謝的損傷,造成與人體衰老基本一致的模型[5]。目前,姬松茸多糖對小鼠的免疫調節(jié)作用鮮有報道。大量文獻表明食用菌多糖一般能夠促進動物的脾臟和胸腺的發(fā)育[6-8],尤其對于還沒有發(fā)育完善或已經受到某種免疫抑制的動物機體的免疫器官作用明顯[9-11]。據報道,真菌多糖能夠提高脾指數,促進機體非特異性免疫和淋巴細胞轉化,提高血液循環(huán)中細胞因子含量,起到免疫調節(jié)作用[12-15]。

因此,本實驗通過觀察姬松茸多糖對小鼠胸腺、脾臟指數的影響,測定脾細胞增殖,并通過檢測免疫細胞因子TNF-α和IL-6含量,探究姬松茸多糖的免疫調節(jié)作用,為進一步開發(fā)姬松茸免疫功能食品提供實驗基礎和理論依據,為姬松茸深入開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姬松茸 沈陽聚鑫北蟲草菌業(yè)有限公司;SPF級雄性ICR小鼠(4～5周齡,體重(20.0±2.0)g,40只,實驗動物許可證編號為SCXK(吉)-2016-0003)、基礎飼料 長春億斯實驗動物技術有限責任公司;葡萄糖標準品 Solarbio公司;D-半乳糖、D-Hank’s液、CCK-8 美國Genview公司;RPMI-1640培養(yǎng)基 塞默飛世爾生物化學制品有限公司;刀豆蛋白A(ConA) 美國Sigma公司;TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒 ABclonal公司。

UV-2550型紫外可見分光光度計 島津國際貿易有限公司;Infinite M200型酶標儀 TECAN;恒溫生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司;SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司;LIFE Countess全自動細胞計數儀 美國Life Technologies公司;低溫高速離心機 美國eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姬松茸多糖的提取 姬松茸子實體粉碎→無水乙醇除雜→濾渣→烘干至恒重→水浸提→過濾→濃縮→醇沉→Sevage法[16]除蛋白→透析→冷凍干燥→姬松茸多糖[17,18]。

操作要點:將姬松茸子實體常溫粉碎,過60目篩。加入無水乙醇除雜,采用紗布進行濾渣,放入烘箱中烘干至恒重,設定一定的料液比、提取溫度、提取時間、提取次數在恒溫水浴鍋中進行水提,過濾并收集濾液,采用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮;用3倍體積的無水乙醇醇沉過夜;室溫下進行Sevage法除去蛋白并過夜;用截留分子量為3500 Da的透析袋,于蒸餾水中透析48 h以除去小分子物質,-80 ℃冷凍干燥3 d,得到姬松茸多糖。

1.2.2 標曲的制作及多糖得率的計算 以葡萄糖為標準品(0.1 mg/mL),苯酚-硫酸法[19]測定冷凍干燥后固體樣品多糖含量,根據標準曲線計算多糖得率。計算公式為:

多糖得率(%)=[(C×D×V)/(W×1000)]×100

式中:C-冷凍干燥樣品多糖濃度(mg/mL);D-樣品稀釋倍數;V-樣品體積(mL);W-樣品質量(g)。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 溫度對多糖得率的影響 固定反應條件為料液比1∶30 g/mL、提取時間為3 h、提取次數為3次,考察不同溫度(60、70、80、90、100 ℃)對多糖得率的影響。

1.2.3.2 時間對多糖得率的影響 固定條件為料液比1∶30 g/mL、提取溫度為80 ℃、提取次數為3次,考察不同提取時間(1、2、3、4、5 h)對多糖得率的影響。

1.2.3.3 料液比對多糖得率的影響 固定反應條件為提取溫度80 ℃、提取時間為3 h、提取次數為3次,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對多糖得率的影響。

1.2.3.4 提取次數對多糖得率的影響 固定每次反應條件為料液比1∶30 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時間為3 h,考察不同提取次數(1、2、3、4、5次)對多糖得率的影響。

1.2.4 正交試驗 以單因素實驗為基礎,進行正交實驗工藝設計,對姬松茸多糖得率影響的因素有提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、提取次數(D),詳見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Level of form factors

1.2.5 實驗動物模型建立及給藥 本實驗需雄性ICR小鼠40只,小鼠適應性喂養(yǎng)1周,實驗期間小鼠自由飲食、飲水,動物室溫度20.0～22.0 ℃,相對濕度50%～60%,將小鼠隨機分成5組,即空白對照組(CON)、模型組(MOD)、姬松茸多糖低劑量組(ABP-L,200 mg/kg)、姬松茸多糖中劑量組(ABP-M,400 mg/kg)、姬松茸多糖高劑量組(ABP-H,800 mg/kg),每組8只。CON組頸部皮下注射生理鹽水,其他各組均頸部皮下注射D-半乳糖溶液復制衰老模型,注射劑量為400 mg/kg。建立模型的同時灌胃給藥,ABP-L、ABP-M、ABP-H組給予相應劑量姬松茸多糖(采用蒸餾水配制),CON與MOD給予等體積蒸餾水,連續(xù)注射及給藥42 d。

1.2.6 測定小鼠臟器指數 末次給藥后,禁食不禁水12 h后,對小鼠進行稱重,使用摘除眼球方法收集血液,并脫頸處死小鼠,取出胸腺及脾臟稱重,計算臟器質量與體重的比值(mg/g)。

臟器指數(mg/g)=臟器質量(mg)/動物體重(g)

1.2.7 刀豆蛋白(ConA)引起的小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應 試劑配制:RPMI培養(yǎng)液加入10%胎牛血清配成脾細胞培養(yǎng)液。用RPMI培養(yǎng)液配制成50 μg/mL ConA液,用0.22 μm的微孔濾膜過濾,分裝后-20 ℃中存放備用。

脾細胞懸液的制備:實驗在無菌操作室內進行,末次給藥結束后將小鼠脫頸椎處死,并用75%的乙醇對小鼠進行消毒處理。在無菌操作臺中解剖小鼠,在玻璃平皿中加入適量D-Hank’s液,用手術鑷子輕輕夾住脾臟,剪掉周圍組織,取出后將其放入平皿中。用注射器對脾臟進行研磨使其分散成單個細胞懸液,用移液槍吸取該細胞懸液，經200目篩網濾入離心管中,并用D-Hank’s液沖洗2次,1000 r/min離心10 min。離心后加入適量配制好的培養(yǎng)基,吹打細胞至均勻,用全自動細胞計數儀計脾細胞數,并調整其濃度為1×107個/mL。

淋巴細胞增殖反應:將脾細胞懸液轉移到96孔培養(yǎng)板中,其中每個孔各加90 μL脾細胞懸液,分為兩組,一組每孔加入10 μL ConA液,另一組設對照組,加入10 μL培養(yǎng)液,置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)終止,用全自動酶標儀檢測570 nm處的光密度(OD)值。

小鼠脾淋巴細胞的增殖轉化(ΔOD570)=ODConA-OD無ConA

1.2.8 血清中TNF-a、IL-6含量測定 將小鼠摘除眼球取血后,離心取上清液。參照酶聯免疫試劑盒說明書的方法測定TNF-α、IL-6的含量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

在490 nm波長處測定的吸光度值,以葡萄糖濃度為橫坐標(mg/mL),吸光度值為縱坐標,繪制葡萄糖含量與吸光度的標準曲線見圖1,計算得回歸方程Y=14.662X-0.0041,決定系數R2=0.9997,線性關系良好。

圖1 葡萄糖溶液標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 單因素實驗結果

由圖2可知,隨著提取溫度的升高,多糖得率呈上升趨勢,在100 ℃時多糖得率最高,為了獲得高得率的同時降低工業(yè)化生產的能耗,本實驗選擇提取溫度80、90、100 ℃三個水平進行正交試驗。由圖3可得,多糖得率隨著提取時間的延長而升高,提取時間高于3 h,多糖得率降低,可能由于提取時間較長會導致植物細胞壁結構破壞,使有效成分流出,造成多糖得率緩慢下降,因此選擇臨近的2、3、4 h三個水平進行正交試驗。由圖4可知,當料液比為1∶20 g/mL時,多糖得率最高,料液比偏小時,固液相中的有效成分的濃度差較小,會使溶液黏性增大,不利于姬松茸多糖的提取,隨著料液比的增大,兩相濃度差增大,多糖在溶劑中的量增大,但料液比過高時,濃度差過大,反而不利于多糖的溶出,因此選擇1∶10、1∶20、1∶30 g/mL進行正交試驗。由圖5可知,當提取次數為3次時,多糖得率最高,隨著提取次數的增加,消耗的材料和資源也較多,并且得率也受到影響,因此選擇2、3、4次三個水平進行正交試驗。

圖2 提取溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on polysaccharides yield

圖3 提取時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on polysaccharides yield

圖4 料液比對多糖得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on polysaccharides yield

圖5 提取次數對多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on polysaccharide yield

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果如表2。

表2 正交試驗結果及極差分析Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

根據表1中正交試驗結果及極差分析可知,各因素對姬松茸多糖影響由大到小依次為提取溫度>提取時間>料液比>提取次數。最佳因素的水平組合為A3B2C2D2。

根據姬松茸多糖提取最佳條件進行三次平行實驗,姬松茸多糖平均得率為8.814%±0.109%。確定的最佳提取工藝與正交試驗中的得率最高組接近,且重復性良好,進一步確定了提取姬松茸多糖的提取工藝A3B2C2D2,即料液比為1∶20 g/mL,100 ℃水浴浸提3次,每次3 h。

2.4 姬松茸多糖對小鼠臟器指數的影響

如圖6、圖7顯示,與空白對照組相比,模型組小鼠的胸腺指數和脾臟指數極顯著降低(p<0.01),說明建立模型成功。與模型組相比,姬松茸多糖低劑量組、中劑量組胸腺指數沒有顯著差異,而姬松茸多糖中劑量脾臟指數顯著升高(p<0.05),姬松茸多糖高劑量組胸腺指數顯著升高(p<0.05),脾臟指數極顯著升高(p<0.01),說明姬松茸多糖高劑量組可以顯著改善臟器指數,由于胸腺與脾臟作為免疫器官,直接能反應動物整體的健康良好狀況,因此姬松茸多糖能夠調節(jié)機體免疫功能。

圖6 姬松茸多糖對小鼠胸腺指數的影響(n=8)Fig.6 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on the proportion of thymus in mice(n=8)注:與CON相比,#代表差異顯著p<0.05,##代表差異極顯著p<0.01;與MOD相比,*代表差異顯著p<0.05,**代表差異極顯著p<0.01;圖7～圖10同。

圖7 姬松茸多糖對小鼠脾臟指數的影響(n=8)Fig.7 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on spleen specific gravity in mice(n=8)

2.5 刀豆蛋白(ConA)引起的小鼠脾臟淋巴細胞增殖轉化結果

如圖8所示,與空白對照組相比,模型組小鼠ConA誘導的淋巴細胞極顯著降低(p<0. 01),表明建模成功。與模型組對比,姬松茸多糖低劑量組小鼠ConA誘導的脾淋巴細胞增殖無顯著性差異,姬松茸多糖中劑量組小鼠ConA誘導的脾淋巴細胞增殖顯著提高(p<0.05),姬松茸多糖高劑量組小鼠ConA誘導的脾淋巴細胞增殖極顯著提高(p<0.01)。說明增加姬松茸多糖劑量促進脾淋巴細胞增殖的作用增強,并顯示量效關系,姬松茸多糖能夠獨立活化小鼠脾淋巴細胞增殖,并且能夠協同促進ConA刺激的脾細胞增殖,側面表明姬松茸多糖能夠通過促進小鼠脾淋巴細胞的增殖而增強機體的免疫功能。

圖8 姬松茸多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響Fig.8 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on the proliferation of mouse splenic lymphocytes

2.6 血清中TNF-α、IL-6含量測定結果

細胞因子是一類由活化的免疫細胞和相關細胞產生的高活性、具有多種生理功能的蛋白質多肽分子或糖蛋白,是免疫系統的重要組成部分[20],也是免疫系統調節(jié)營養(yǎng)代謝的主要介質,細胞因子含量的高低表明了免疫系統的自身代謝狀態(tài)。TNF-α對免疫反應、機體代謝、炎癥反應具有明顯的調節(jié)和介導作用,可促進淋巴細胞增殖。IL-6是由單核細胞、激活的淋巴細胞及多種活性細胞分泌的具有生物活性物質,可誘導免疫細胞的增殖、分化,在活化、增殖的B細胞分化為漿細胞的過程中起關鍵作用,對機體的天然免疫和獲得性免疫都具有重要的調節(jié)作用。

圖9～圖10顯示,與空白對照組相比,模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6含量顯著(p<0.05)減少;與模型組相比,隨著姬松茸多糖劑量的增加,可促進血清中TNF-α、IL-6的分泌,并且姬松茸多糖高劑量組能極顯著(p<0.01)促進衰老小鼠血清中TNF-α、IL-6的分泌,并且TNF-α、IL-6的分泌趨勢相近。說明姬松茸多糖可促進細胞因子TNF-α、IL-6的產生,從而促進淋巴細胞的增殖,有誘導免疫細胞的活化,最終調節(jié)機體的免疫功能。

圖9 姬松茸多糖對衰老小鼠血清中TNF-α含量的影響Fig.9 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on serum TNF-α in aging mice

圖10 姬松茸多糖對衰老小鼠血清中IL-6含量的影響Fig.10 Effect of Agaricus blazei polysaccharides on serum IL-6 in aging mice

3 結論

采用水提醇沉法提取姬松茸多糖,通過單因素實驗和正交實驗篩選并優(yōu)化姬松茸最佳提取工藝為:提取溫度100 ℃,提取時間3 h,料液比1∶20 g/mL,提取次數3次,此時姬松茸多糖平均得率為8.814%±0.109%。小鼠注射D-半乳糖后,與空白對照組小鼠相比,胸腺指數和脾臟指數均極顯著下降,經ConA刺激的模型組小鼠脾細胞增殖也同時受到抑制,說明D-半乳糖導致小鼠免疫力下降模型建立成功。與模型組相比,姬松茸多糖高劑量組極顯著提高小鼠脾臟(p<0.01),顯著提高胸腺指數(p<0.05),姬松茸多糖高劑量組極顯著促進衰老小鼠脾細胞增殖(p<0.01),極顯著增加衰老小鼠血清中TNF-α、IL-6(p<0.01)含量。

本實驗研究中姬松茸多糖能顯著增加小鼠胸腺指數,并促進脾細胞增殖轉化,促進小鼠血清中TNF-α、IL-6的分泌來調節(jié)免疫功能。因此姬松茸多糖對D-半乳糖誘導的衰老小鼠具有免疫調節(jié)作用,為開發(fā)姬松茸系列產品奠定理論和實踐基礎。