林佳艷　王文文　唐梅

摘? ?要? ?蚓激酶是從蚯蚓體內(nèi)提取的一組具有激酶和纖溶酶活性的蛋白質(zhì)，能夠溶解血栓，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。試驗(yàn)采用硫酸銨粗提取的方法，從峨眉山大蚯蚓（秉前環(huán)毛蚓）體內(nèi)提取蚓激酶粗提取物，測定其生物活性，并探討pH值、金屬離子及溫度對粗提物酶活性的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：1）pH值、金屬離子及溫度對粗提物酶活性有影響。2）pH值在5～12，蚓激酶活性相對比較穩(wěn)定，當(dāng)pH=8時(shí)，酶活性達(dá)到最大值;3）Pb2+、Hg2+抑制酶活性;K+、Ca2+和Fe2+促進(jìn)酶活性;4）當(dāng)溫度在60 ℃以下時(shí)，酶活性較高且穩(wěn)定性好;大于80 ℃時(shí)幾乎完全失活。

關(guān)鍵詞? ?峨眉山大蚯蚓;秉前環(huán)毛蚓;蚓激酶;酶活性;纖溶酶

中圖分類號(hào)：Q814? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.19.017

蚯蚓，又名地龍，屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門寡毛綱[1]。世界上蚯蚓大約有2 500種，入藥史長達(dá)四千年之久[2]。在中國醫(yī)藥學(xué)歷史上，蚯蚓可作為傳統(tǒng)中藥，具有降壓、利尿、清熱等作用。蚯蚓除作為傳統(tǒng)中藥外，還可從其體內(nèi)提取活性物質(zhì)，如蚓激酶、多種氨基酸等[3]。蚯蚓喜歡在潮濕陰暗、較疏松及腐殖質(zhì)多的土壤中營穴居生活，通常晝伏夜出，能夠有效地躲避天敵[4]。

日本美原恒等從粉正蚓（Lumbricus rubellus）體內(nèi)分離出一種具有溶纖作用的粗提物，并命名為蚓激酶[5]。蚓激酶具有激酶和纖溶酶活性，有溶解血栓作用，是目前世界上極具開發(fā)價(jià)值的纖溶類藥物。程牛亮[6]分離得到相對分子質(zhì)量為36 000和29 000的兩種纖溶酶組分，能夠較好地溶解纖維蛋白及家兔血凝塊。鄧國寶等[7]發(fā)現(xiàn)蚓激酶具有良好的降低血糖、血脂功能。董強(qiáng)等[8]發(fā)現(xiàn)蚓激酶可用來治療和預(yù)防缺血性腦血管疾病。

峨眉山大蚯蚓，學(xué)名為秉前環(huán)毛蚓（Pheretima praepinguis），是峨眉山的特有種，主要分布在峨眉山的龍門洞（海拔約600 m）至萬年寺（海拔約1 000 m）[4]。峨眉山大蚯蚓肌肉很發(fā)達(dá)，伸縮能力強(qiáng)，可有效改善和凈化土壤。本試驗(yàn)從峨眉山大蚯蚓體內(nèi)提取蚓激酶粗提物，測定其生物活性，并探討pH值、金屬離子及溫度對粗提物酶活性的影響，為研發(fā)蚓激酶類藥物提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為峨眉山大蚯蚓（秉前環(huán)毛蚓），2017年7月在峨眉山報(bào)國寺、清音閣、萬年寺和洪椿坪一帶（海拔500～1 200 m）采得。峨眉山大蚯蚓先進(jìn)行粗提，蚓激酶粗提物置-4 ℃恒溫箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蚓激酶粗提物的提取

提取蚓激酶工藝流程為[9]：原材料蚯蚓→多次水洗→稱重量→加入緩沖溶液→勻漿機(jī)勻漿→離心→取上清液加入硫酸銨→離心→上清液加入硫酸銨→高速離心→收集沉淀→透析去掉鹽→冷凍干燥凍干→蚯蚓粗制品。

1.2.2 蚓激酶粗提物濃度測定

測定蚓激酶粗提物濃度，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定蚓激酶溶液在波長為595 nm下測定其吸光度值[10]，得出濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.006 9x+0.002 1，系數(shù)R2=0.988 3。詳見圖1。

1.2.3 蚓激酶粗提物的活性測定

蚓激酶粗提物活性的測定采用酶解雞血塊方法[11]。

1.2.4 蚓激酶粗提物pH穩(wěn)定性測定及最適pH值

蚓激酶粗提物pH穩(wěn)定性測定及最適pH值參考周海等的方法[12]。

1.2.5 測定各種金屬離子對蚓激酶粗提物活性的影響

測定各種金屬離子對蚓激酶粗提物活性的影響參考謝德芳的方法[2]。

1.2.6 蚓激酶粗提物熱穩(wěn)定性以及最適溫度的測定

蚓激酶粗提物熱穩(wěn)定性以及最適溫度的測定參考鄧志會(huì)的方法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚓激酶粗提物的制備

本試驗(yàn)新鮮峨眉山大蚯蚓的總用量為875.65 g，通過鹽析粗提、透析去鹽、冷凍干燥后得到蚓激酶粗提物7.18 g，蚓激酶的產(chǎn)率為0.82%，蚓激酶產(chǎn)率較低。由圖1可知，取1 mL蚓激酶液進(jìn)行測定，得到吸光度值為0.365，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可知蚓激酶液的濃度為52.6 μg·mL-1。

2.2 蚓激酶粗提物酶活性的檢測

由表1可知，第3組上清液蛋白質(zhì)含量較第一、二組含量高。在雞血塊被酶解后，所含可溶性蛋白質(zhì)含量明顯提高，由0.24%上升到0.62%。由此可知，蚓激酶粗提物具有酶活性，能夠酶解雞血塊使其蛋白含量增加。

2.3 蚓激酶粗提物的pH穩(wěn)定性測定

混合液放置一段時(shí)間，進(jìn)行活性測定，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)pH<3時(shí)，蚓激酶幾乎失去活性;在pH在5～12，蚓激酶活性相對比較穩(wěn)定;在pH=8時(shí)，酶活性達(dá)到最大值;雖然在pH>9后，酶活性雖有所下降，但其活性相對仍較高;可見，蚓激酶在堿性環(huán)境，其活性相對較強(qiáng)。

2.4 金屬離子對蚓激酶的活性影響

由圖3可知，K+、Ca2+和Fe2+能夠提高蚓激酶活力;而Pb2+和Hg2+對酶活有抑制作用。金屬離子作為酶的激活劑還是抑制劑，主要取決于金屬離子與酶活性中心基團(tuán)是否發(fā)生作用。若某一金屬離子能與酶某一活性中心基團(tuán)作用結(jié)合，抑制酶發(fā)揮正常作用，如重金屬離子Pb2+、Hg2+就可以和酶活性中心的-SH作用而抑制酶活性。金屬離子如K+、Ca2+和Fe2+等對酶活性就起促進(jìn)作用。

2.5 蚓激酶粗提物的熱穩(wěn)定性及最適溫度的測定

將蚓激酶粗提物放在不同溫度水浴鍋保溫2 h后，測定蚓激酶活性。如圖4所示，蚓激酶粗提物在溫度60 ℃以下保溫2 h，其酶活性相對穩(wěn)定，沒有顯著變化;但溫度高于60 ℃，蚓激酶活性發(fā)生變化，曲線呈下降趨勢，且斜率相對較大，說明酶活性下降速率較快;當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃以上時(shí)，蚓激酶幾乎完全失去活性。由此可知，蚓激酶具有很好的溫度穩(wěn)定性，可以在常溫下進(jìn)行提取和儲(chǔ)存。

3 結(jié)論與討論

遲玉杰等[14]研究表明，蚓激酶在pH=8.0時(shí)的活性最高。蚓激酶的最適溫度為57 ℃，熱穩(wěn)定性好;蚓激酶其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，強(qiáng)酸強(qiáng)堿能夠破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，使得蚓激酶失去了生物活性。

由試驗(yàn)可知，在偏堿性條件下，蚓激酶的活性相對較強(qiáng)，pH值在5～12時(shí)，蚓激酶的活性都較強(qiáng);pH=8.0時(shí)，蚓激酶的活性最高;pH<3蚓激酶幾乎完全失去活性。可見，蚓激酶具有較好的pH穩(wěn)定性，能夠較好地適應(yīng)堿性環(huán)境，如腸道堿性環(huán)境。若將蚓激酶加工成腸制劑，蚓激酶在腸道中可以保持較高的活性，發(fā)揮作用時(shí)間長，但是如果位于胃液較強(qiáng)酸性（pH值一般在0.9～1.5）環(huán)境中，蚓激酶失去活性，不能正常發(fā)揮作用。

金屬離子對蚓激酶的作用有所差別，K+、Ca2+和Fe2+能夠增強(qiáng)蚓激酶活力，起著激活劑作用;而Pb2+和Hg2+抑制酶活性，起著抑制劑作用，與遲玉杰等[14]研究結(jié)果相似。

劉美艷等[15]研究證明，在蚓激酶活性不被破壞的條件下，通過較長時(shí)間水浴保溫，蚓激酶活性仍能保持在50%以上。本試驗(yàn)也表明蚓激酶粗提物的熱穩(wěn)定性比較強(qiáng)，能夠較好的適應(yīng)溫度的變化。因此，蚓激酶藥劑在室溫下能儲(chǔ)存。

蚓激酶有溶解血栓和防止血栓形成等作用，其應(yīng)用前景廣闊，直接從蚯蚓中提取蚓激酶，量少且花費(fèi)大，目前蚓激酶還沒有基因工程產(chǎn)品，后期可以利用基因工程技術(shù)進(jìn)行蚓激酶基因的轉(zhuǎn)移及表達(dá)研究;為進(jìn)一步研究純化、研究構(gòu)效的關(guān)系，在增強(qiáng)或保持其催化活性的前提下通過對其某些特定氨基酸殘基的突變或是通過相關(guān)結(jié)構(gòu)域的刪除、增加或融合等手段，以期提高對纖維蛋白的選擇性、提高對纖溶酶原激活劑、抑制劑的抗性，延長其在血液循環(huán)中的半衰期，導(dǎo)向溶栓、抗血栓形成等是今后蚓激酶的研究方向;同時(shí)為后期蚓激酶的開發(fā)和批量生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）