王一珍，賀建東2，韓沖芳2，郭大鵬，王志豪

作為一種使用安全、有效性穩(wěn)定的吸入性麻醉劑，七氟醚自誕生以來逐漸成為日常麻醉工作中重要的麻醉藥物[1]。研究證實(shí)七氟醚具有一定程度的心肌保護(hù)作用，而其中的作用機(jī)制尚未明確[2]。自噬是機(jī)體清除受損細(xì)胞器、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機(jī)制，大量研究已證實(shí)自噬參與心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia and reperfusion injury，MIRI)的各個(gè)階段[3]。動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是位于細(xì)胞質(zhì)中介導(dǎo)細(xì)胞分裂的蛋白，被證實(shí)具有介導(dǎo)自噬并保護(hù)心肌的作用[4]。由此假設(shè)七氟醚對大鼠MIRI的保護(hù)作用與Drp1及自噬有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大鼠MIRI模型，給予七氟醚后處理并測定相關(guān)心肌損傷指標(biāo)及蛋白表達(dá)，探究Drp1和自噬在七氟醚后處理大鼠心肌保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，健康成年雄性SD大鼠45只，體重200～230 g，以隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)和七氟醚后處理組(SpostC組)，各15只。所有實(shí)驗(yàn)操作均已獲得山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會許可。

1.2 心肌缺血再灌注實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?45只大鼠由20%烏拉坦以0.6 mL/100 g麻醉后固定于無菌保溫操作臺，四肢連接針狀電極，由BL NewCentury機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄其心率(HR)、心電圖(ECG)。頸正中切口入路行氣管切開術(shù)，連接小型動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟軟件有限公司，型號HX-101E)，調(diào)整呼吸參數(shù)為頻率60次/min，潮氣量2～3 mL/100 g，吸呼比1∶2，氧流量1 L/min，七氟醚揮發(fā)罐一端與氧氣管連接，一端與動(dòng)物呼吸機(jī)連接，待生命體征穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)。采用文獻(xiàn)[5]方法制備大鼠MIRI模型，于大鼠胸骨左緣心尖搏動(dòng)最強(qiáng)處剪開胸骨暴露心臟，以7-0帶針縫線沿左心耳下方找到冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)穿過，穩(wěn)定15 min后開始實(shí)驗(yàn)。Sham組僅于LAD下穿線而不結(jié)扎，觀察150 min；I/R組在LAD下穿過縫線后，在縫線末端穿過聚乙烯導(dǎo)管，拉緊縫線結(jié)扎LAD，以結(jié)扎部位以下心肌發(fā)白，ECG示ST段抬高為缺血模型成功，30 min后松開扎線，以蒼白部位轉(zhuǎn)紅、ST段下移為再灌注成功，觀察120 min；SpostC組于再灌注前吸入2.5%七氟醚5 min后進(jìn)行再灌注，觀察120 min。

1.3 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法測量心肌梗死面積 每組5只大鼠于再灌注結(jié)束后再次結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，于右頸內(nèi)靜脈注入伊文氏藍(lán)染液1 mL，觀察大鼠口唇和四肢藍(lán)染2 min后取下心臟，洗凈血液，于-20 ℃短暫冰凍20 min后取出，垂直于心臟長軸將心臟均勻切成2 mm左右切片，經(jīng)過TTC染色、固定后制成切片，圖像經(jīng)掃描后由ImageJ軟件進(jìn)行分析計(jì)算，藍(lán)色為非缺血區(qū)，紅色為缺血危險(xiǎn)區(qū)，灰白色為壞死區(qū)。計(jì)算心肌梗死面積(infraction size，IS)值，IS=心肌梗死區(qū)占總截面百分比/危險(xiǎn)區(qū)占總截面百分比。

1.4 Drp1及微血管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白表達(dá)測定(Western-blot法) 余10只大鼠于再灌注結(jié)束后迅速在冰上稱取心肌心尖部組織，以清潔剪刀將組織剪碎，并將其放入裂解液，經(jīng)過裂解、離心后取上清液，按照BCA蛋白檢測試劑(Thermo Scientific，23225)說明進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度檢測，計(jì)算上樣量，隨后進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)模、孵育，后加入一抗Drp1多克隆抗體(1∶1 000，ABclonal，A2470)和LC3B-兔多克隆抗體(1∶1 000，proteintech，18725-1-AP)4 ℃孵育過夜、漂洗，后孵育HRP山羊抗兔二抗(1∶2 000，ABclonal，AS014)并漂洗。最后進(jìn)行顯影、定影、成像。使用ImageJ量化圖像，并使用Photoshop處理圖像，得到經(jīng)典WB條帶形式。

1.5 病理切片染色形態(tài)學(xué)觀察 取下蛋白檢測材料同時(shí)再取部分心尖部組織，用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)經(jīng)過多聚甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片等一系列加工后將其制成切片，并將適量中性樹膠封固切片，標(biāo)記后用光學(xué)顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)，明確心肌細(xì)胞凋亡及損傷程度。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心肌梗死面積比較 與Sham組比較，I/R組和SpostC組大鼠心肌梗死面積均增大(P<0.01)；與I/R組比較，SpostC組大鼠心肌梗死面積減少(P<0.05)。詳見表1。

組別只數(shù) IS值 Sham組50.1±0.5I/R組537.0±1.21)SpostC組526.3±2.61)2)

與Sham組比較，1)P<0.01；與I/R組比較，2)P<0.05

2.2 3組大鼠Drp1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較 I/R組與SpostC組Drp1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平較Sham組升高(P<0.05)；與I/R組比較，SpostC組Drp1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。詳見表2。

組別只數(shù)Drp1LC3-ⅡSham組 100.47±0.07 0.27±0.04 I/R組100.78±0.071)0.62±0.061)SpostC組 100.58±0.061)2)0.46±0.061)2)

與Sham組比較，1)P<0.05；與I/R組比較，2)P<0.05

2.3 心肌HE染色結(jié)果 光鏡下可見Sham組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊，染色較均勻，細(xì)胞核居中；I/R組心肌細(xì)胞形態(tài)改變，心肌纖維排列紊亂，可見部分纖維斷裂，細(xì)胞核破壞，可見較多炎性細(xì)胞，染色不均勻；與I/R組比較，SpostC組心肌細(xì)胞形態(tài)較正常，心肌纖維排列較整齊，可見細(xì)胞質(zhì)輕度破壞，胞核相對完整，炎性細(xì)胞減少。詳見圖1。

圖1 3組大鼠心肌細(xì)胞HE染色結(jié)果(×400)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[5]的方法，以結(jié)扎大鼠心肌冠狀動(dòng)脈左前降支30 min，放松120 min的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型。研究結(jié)果顯示，I/R組在結(jié)扎后出現(xiàn)心電圖ST段抬高、結(jié)扎部位以下區(qū)域變白，并于松開扎線后ST段下移，蒼白區(qū)域變紅，120 min再灌注后心肌發(fā)生梗死，主要表現(xiàn)為IS值的增大及病理染色心肌細(xì)胞形態(tài)的變化，提示心肌缺血再灌注模型建立成功。

自噬主要由Beclin-1-Vps34和mTORC1兩條通路介導(dǎo)，整個(gè)自噬過程分為自噬發(fā)動(dòng)、自噬小泡形成、自噬體膜延伸、自噬體融合和降解、自噬終止5個(gè)過程[6]。而LC3-Ⅰ位于細(xì)胞質(zhì)中，在自噬發(fā)動(dòng)后，在自噬相關(guān)蛋白7(Atg7)和自噬相關(guān)蛋白5(Atg5)的作用下形成LC3-Ⅱ，參與自噬體膜的融合延伸，LC3-Ⅱ的增加(或同時(shí)伴LC3-Ⅰ的減少)是自噬表達(dá)上調(diào)的典型標(biāo)志[7]。Drp1作為代表細(xì)胞分裂的蛋白，同時(shí)被發(fā)現(xiàn)具有介導(dǎo)自噬的作用[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sham組存在Drp1及LC3-Ⅱ蛋白低水平的表達(dá)，表明在正常心肌細(xì)胞代謝過程中存在一定程度的細(xì)胞分裂和自噬，其存在可能與維持細(xì)胞正常能量代謝有關(guān)[8]。

自噬在心肌缺血再灌注過程中的作用是一個(gè)變化的過程，在心肌缺血階段，一定程度的自噬可保護(hù)心肌免于缺氧損傷，而再灌注過程中，過度上調(diào)的自噬加速了心肌細(xì)胞的死亡[9-10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)I/R組心肌LC3-Ⅱ及Drp1表達(dá)均上調(diào)，心肌細(xì)胞IS值增大且病理染色出現(xiàn)損傷變化，表明再灌注期間Drp1及自噬表達(dá)上調(diào)，對心肌細(xì)胞造成損害。當(dāng)給予七氟醚后處理后，Drp1及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平下降，提示心肌細(xì)胞分裂及自噬下調(diào)，且心肌細(xì)胞損傷程度減輕，表現(xiàn)在IS值下降及病理HE染色改變，提示七氟醚后處理能夠減輕MIRI，同時(shí)下調(diào)Drp1及LC3-Ⅱ的表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞自噬，進(jìn)一步提示Drp1及自噬在七氟醚后處理心肌保護(hù)中具有重要作用。

本實(shí)驗(yàn)為在體實(shí)驗(yàn)，無法排除在體神經(jīng)、體液等復(fù)雜因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究；隨著對細(xì)胞分裂及自噬的進(jìn)一步深入研究，應(yīng)行細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)基因敲除實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究七氟醚心肌保護(hù)的細(xì)胞機(jī)制，更加深入了解其相關(guān)信號蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。