羅冬蘭，黎曉燕，2，曹森，2，巴良杰，2，*

（1.貴陽學院，貴州貴陽550005；2.貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州貴陽550005）

茶，山茶科植物，多年生常綠木本植物，其植株形態(tài)分灌木型、喬木型和半喬木型。茶樹起源于低緯度的亞熱帶區(qū)域，中心區(qū)大部分集中在云南、貴州、四川相連的高原山地地帶。貴州位于茶樹的起源中心區(qū)，是國內唯一低緯度、高海拔、寡日照兼具的區(qū)域，全省地勢西高東低，自中部向北、東、南三面傾斜，西部海拔1 500 m～2 800 m，中部海拔1 000 m左右，北、東、南三面邊緣河谷地帶海拔在500 m以下。氣候屬于亞熱帶濕潤季風氣候區(qū)，溫暖濕潤，大部分地區(qū)年平均氣溫在15℃左右，年降水量多在1 100 mm～1 300 mm之間，年日照時數約1 300 h，土壤大多呈酸性或微酸性[1]?？傊?，貴州特點的地理環(huán)境，十分有利于茶樹的生長。

目前，茶葉是僅次于水的第二大飲品，它含有豐富的純天然酚類抗氧化劑[2]。研究表明，茶的茶多酚可以有效地清除人體內的脂自由基和氧自由基，有效的預防脂質過氧化，還有延緩衰老、抑制腫瘤的發(fā)生等功能，其中，綠茶以其清新的顏色，深受廣大消費者喜愛[3]。貴州省是我國綠茶種植面積大省之一，茶葉品種豐富。遵義、黔南、安順等地先后出現(xiàn)了一批名茶深加工企業(yè)，但是對貴州不同品種茶葉的特性橫向比較研究鮮見報道。近年來，強抗氧化活性已經成為天然資源的篩選和評價的重要標準之一[4]。另外，隨著人們消費水平的提高，茶顏色也成為茶品質的評價標準之一[5]。

本研究對貴州5種（湄潭翠芽茶、石阡苔茶、鳳岡鋅硒茶、貴定云霧貢茶、都勻毛尖）名優(yōu)茶葉的抗氧化性成分、抗氧化活性及茶湯顏色進行評價比較，研究結果可以為提升貴州省茶葉品牌、開發(fā)茶葉深加工產品，延伸茶產業(yè)鏈提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶樣品

5種貴州名優(yōu)綠茶分別為A：湄潭縣的湄潭翠芽茶，B：石阡縣的石阡苔茶，C：鳳岡縣的鳳岡鋅硒茶，D：貴定縣的貴定云霧貢茶，E：都勻市的都勻毛尖。茶葉購買于市場，茶葉均為清明節(jié)前采摘的當年新茶。

1.1.2 試劑

碳酸鈉、沒食子酸、過硫酸鉀、福林酚、三氯化鐵、氯化亞鐵、吐溫-80：生工生物工程股份有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-聯(lián)氨-雙二胺鹽 [2，2′-azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）di-ammonium salt，ABTS]、奎諾二甲基丙烯酸酯（水溶性維生素E）（6-hyd-roxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、2，4，6-三吡啶三吖嗪（2，4，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）：Sigma-Aldrich；化學試劑均為市售分析純級。

1.1.3 儀器

UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司；安捷倫1100高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；VP-ODS C-18 柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：大連依利特公司；ColorQuest XE色差儀：美國HunterLab公司。

1.2 方法

1.2.1 茶湯的制備

將待測的5種茶葉用研缽磨成粉末狀態(tài)，然后用40目篩進行過濾。取1.0 g茶葉樣品置于試劑瓶中，加入250 mL沸騰的超純水。保持試劑瓶振蕩浸泡1 h后，冷卻，過濾殘渣，4℃避光保存，用于抗氧化成分、抗氧化活性和茶湯顏色的測定。

1.2.2 抗氧化成分的測定

1.2.2.1 茶多酚

茶多酚含量的測定采用福林酚法進行，其含量用mg/mL 表示[6]。

1.2.2.2 總黃酮

總黃酮含量的測定參照何書美等[7]的三氯化鋁法測定，單位以mg/mL表示。

1.2.2.3 沒食子酸

沒食子酸含量的測定參照折改梅等[8]的高效液相色譜 （high performance liquid chromatography，HPLC）法，以mg/mL表示。

1.2.2.4 茶黃素和兒茶素

茶黃素及兒茶素含量的測定參考王坤波等[9]的高效液相色譜（HPLC）法，以mg/mL表示。

1.2.3 抗氧化能力的測定

1.2.3.1 鐵還原氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法

采用FRAP法測定茶湯抗氧化活性[10]。取稀釋一定倍數的茶湯50 μL，加入1.0 mL TPTZ工作液，混勻后37℃反應30 min，在波長593 nm處測定溶液吸光度。然后使用不同濃度的 Trolox（50 μmol/L～1 000 μmol/L）制作標準曲線。茶湯樣品抗氧化活性（FRAP值）用達到同樣吸光度所需的Trolox（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）的物質的量（mmol TEAC/100 g）表示。

1.2.3.2 ABTS法

茶湯的總抗氧化能力參照金亮等[11]的ABTS法進行測定。測定前按體積比2∶1將ABTS母液7 mmol/L與過硫酸鉀溶液2.45 mmol/L進行混合，于（20±2）℃避光條件下靜置過夜，反應得到ABTS陽離子溶液。將上述溶液用適量80%乙醇稀釋至波長734 nm處的吸光率為0.700±0.002。取稀釋好的ABTS+溶液4.0 mL，加入一定稀釋倍數的0.1 mL茶湯，混勻，（20±2）℃條件下反應6 min，測734 nm處的吸光值。以Trolox（50 μmol/L～800 μmol/L）為標樣制作標準曲線。最后結果用每100 g樣品清除ABTS+自由基能力相當于Trolox（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）的物質的量（mmol TEAC/100 g）來表示。

1.2.3.3 DPPH法

參照金亮等[11]的DPPH自由基清除活性方法，來測定茶湯的抗氧化活性。取稀釋一定倍數的0.1 mL茶湯加入到4.0 mL甲醇稀釋DPPH溶液（吸光率0.700±0.002），充分混勻，在（20±2）℃條件下反應 6 h，然后在517 nm 處測吸光值。以 Trolox（50 μmol/L ～800 μmol/L）為標樣制作標準曲線。最終測量結果以每100 g樣品清除DPPH自由基能力相當于Trolox（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）的物質的量（mmol TEAC/100 g）來表示。

1.2.4 茶湯顏色的測定

5種茶湯顏色使用ColorQuest XE色差儀進行測定。顏色結果參數用三色參數表示，分別為 L*，a*，b*。L*指明度指數，a*、b*為色品指數。茶湯彩度（C*）=（a*2+b*2）1/2。色相角（hue angle，H°）=tan-1（b*/a*）（a*＞0，b*＞0）或H°=tan-1（b*/a*）+180（a*＜0，b*＞0）[12]。

1.2.5 數據分析處理

采用OriginPro 8.0軟件對數據進行統(tǒng)計處理，采用SPSS19.0軟件的Duncan氏新復極差法進行數據差異顯著性分析（P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著）。

2 結果與分析

2.1 抗氧化成分

5類茶葉的茶多酚、總黃酮、沒食子酸、茶黃素及兒茶素含量見表1。

表1 5類茶葉的抗氧化成分Table 1 Antioxidant components of five kinds of tea

茶葉在加工過程中，首先經過殺青過程，使茶葉中過氧化酶和多酚氧化酶等酶失去活性，進而阻止了茶多酚等多酚類物質進一步被酶氧化。茶中的酚類物質是茶當中的主要抗氧化活性物質，其主要成分為兒茶素類，以α-苯基苯駢吡喃為結構基礎，羥基取代基作為質子的供體，容易形成酚羥基和醌型的中間形態(tài)，并使其具有特殊的生理活性與功能，如：抗輻射、抗腫瘤、抗衰老、抑菌及抗病毒等作用，這些功能與其抗氧化能力有著密切關系[13]。通過茶多酚含量的測定，發(fā)現(xiàn)5類茶中茶多酚含量差異顯著（P＜0.05），依次大小為：B石阡苔茶＜E都勻毛尖＜D貴定云霧＜C鳳岡鋅硒＜A湄潭翠芽（見表1）。

5類茶葉中總黃酮含量均比較低，A湄潭翠芽和C鳳岡鋅硒之間無顯著差異，B石阡苔茶、E都勻毛尖和D貴定云霧之間差異顯著，其中A湄潭翠芽總黃酮含量最高為0.084 mg/mL，E都勻毛尖含量最低為0.063 mg/mL（見表 1）。

在茶葉中，沒食子酸是茶多酚的重要組成單元，它以酯的形式連接在兒茶素的3位羥基上，從而形成一系列的酯型兒茶素衍生物，它具有顯著地抗氧化活性，并且有抗腫瘤、抗突變、抗菌等作用[8]。由表1可知，5類茶葉中沒食子酸含量差異顯著（P＜0.05），但大小與茶多酚含量呈現(xiàn)相反趨勢，依次為A湄潭翠芽＜E都勻毛尖＜D貴定云霧＜B石阡苔茶＜C鳳岡鋅硒。

由表1可知，五類茶的兒茶素含量，差異顯著（P＜0.05），且D貴定云霧含量最高，其次是A湄潭翠芽。茶黃素含量相對比較低，最高的為A湄潭翠芽0.546 mg/mL，最低的為D貴定云霧0.147 mg/mL。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 FRAP法測定抗氧化活性

5種不同茶葉鐵還原氧化能力（FRAP）比較結果見圖1。

FRAP法測定抗氧化活性的原理為被檢測物將Fe3+還原為Fe2+的能力，該方法操作簡便、重復性高，易于標準化，已經廣泛應用于茶葉及其它植物提取物的抗氧化活性檢測。5種不同茶葉的鐵還原氧化能力（FRAP）差異顯著（P＜0.05），F(xiàn)RAP值大小依次為：B 石阡苔茶＜E都勻毛尖＜C鳳岡鋅硒＜D貴定云霧＜A湄潭翠芽，其中FRAP值最大的A湄潭翠芽是最低的B石阡苔茶的2.2倍。綜上，通過FRAP法測定茶葉的抗氧化活性，得出A湄潭翠芽的抗氧化活性最高。

圖1 5種不同茶葉鐵還原氧化能力（FRAP）比較Fig.1 Ferric reducing antioxidant power（FRAP）of five different teas

2.2.2 ABTS法自由基清除活性測定

5種不同茶葉ABTS+自由基清除活性比較結果見圖2。

圖2 5種不同茶葉ABTS+自由基清除活性比較Fig.2 Compare of antioxidant activity of five different teas on ABTS+free radicals

ABTS法測定自由基清除活性過程中，ABTS經硫酸鉀氧化后生產穩(wěn)定的藍綠色物質——ABTS+自由基陽離子[11]。當反應液中有供氫能力的抗氧化劑存在時，ABTS+·與之反應，進而生產無顏色的ABTS。由圖2可知，5種不同綠茶對ABTS+自由基的清除活性差異顯著（P＜0.05）。ABTS+自由基的清除活性大小依次為：E都勻毛尖＜B石阡苔茶＜C鳳岡鋅硒＜D貴定云霧＜A湄潭翠芽，其中清除活性最大的A湄潭翠芽是最低的E都勻毛尖的1.8倍。由此可知，A湄潭翠芽茶的ABTS+自由基的清除活性最好，其次是D貴定云霧茶。

2.2.3 DPPH法自由基清除活性測定

5種不同茶葉DPPH自由基清除活性比較結果見圖3。

圖3 5種不同茶葉DPPH自由基清除活性比較Fig.3 Compare of antioxidant activity of five different teas on DPPH free radicals

DPPH測定自由基清除活性過程中，DPPH可以提供一種比較穩(wěn)定的質子自由基，它的甲醇溶液呈現(xiàn)紫色，并且在517 nm波長處有著最大吸收值。當反應液中有抗氧化劑提供氫能力的時候，DPPH溶液顏色變淺，且吸光值變小?？梢酝ㄟ^測定DPPH自由基含量（吸光度）的變化來評價物質的抗氧化活性[11，14]。由圖3可知，在測試的5種不同綠茶中，DPPH自由基的清除活性超過200 mmol TEAC/100 g的有A湄潭翠芽（241.67 mmol TEAC/100 g）和C鳳岡鋅硒（219.33 mmol TEAC/100 g），而活性最低為E都勻毛尖（177.33 mmol TEAC/100 g）、B 石阡苔茶（146.33 mmol TEAC/100 g）。研究發(fā)現(xiàn)，A湄潭翠芽茶相對于其它4種綠茶的清除活性較好。

2.3 茶湯顏色參數

5種綠茶茶湯顏色參數的數據分析結果見表2。

表2 5類茶葉茶湯顏色參數Table 2 Color parameters of five kinds of tea

L*表示茶湯的透明度；a*、b*為色品指數，a*表示從紅色至綠色的范圍，數值正數表示紅色，負數表示綠色，b*表示從藍色至黃色的范圍，數值正數表示黃色，負數表示藍色；彩度C*表示茶湯顏色的亮度或飽和度；色相角H°范圍為0或360、紅-紫色，90、黃色，180、綠色，270、藍色。L*值最高的是A湄潭翠芽，最低的是E都勻毛尖，湄潭翠芽茶湯的透明度最好，而都勻毛尖的透明度最差。5種綠茶茶湯的a*值均為負值，表示5種茶湯的顏色均是不同程度的綠色，且5種茶湯之間差異顯著（P＜0.05）；b*值大小決定茶湯中黃色程度，大小依次為：A湄潭翠芽＜C鳳岡鋅硒＜B石阡苔茶＜D貴定云霧＜E都勻毛尖，A湄潭翠芽茶湯中黃色程度最低，E都勻毛尖茶湯中黃色程度最高。5種茶湯的彩度C*值差異顯著（P＜0.05），和b*值變化趨勢基本一致。5種綠茶的H°都高于90，且5種之間差異顯著（P＜0.05），表示茶湯的顏色均為黃綠色。

2.4 相關性分析

對茶葉的抗氧化性與抗氧化成分、茶湯的顏色進行相關性分析，結果見表3。

由表3可知，茶多酚的含量與FRAP法、ABTS法呈顯著性正相關（P＜0.05），與DPPH法呈極顯著的正相關（P＜0.01），相關系數分別為：0.838、0.820、0.976。結果表明，在茶葉的抗氧化成分中，茶多酚含量是影響抗氧化活性的重要因素，這與以前的研究報道一致[15]。另外，可以得出FRAP法、ABTS法和DPPH法3種方法在評價茶葉抗氧化活性時都呈現(xiàn)出顯著的相關性，說明它們都適合茶葉的抗氧化活性測定，并且這3種方法之間可以起到相互補充的作用，這與金亮等[11]的研究報道相符合。本試驗結果中，發(fā)現(xiàn)總黃酮含量與ABTS法和DPPH法顯著性相關（P＜0.05），相關系數為0.948和0.898，這一結果表明，總黃酮的含量也影響著茶葉的抗氧化活性。茶多酚類物質是茶葉的主要抗氧化活性物質，主要是以α-苯基苯駢吡喃為結構基礎的類黃酮化合物，羥基取代基作為質子的供體，使其具有特殊的生理活性與功能，直接作用于與自由基以及相關的酶[13]。黃酮類的基本結構為C6-C3-C6，以游離甙元形式和與不同糖結合形成的甙存在，由于其分子結構中具有數量不等的酚羥基而有較強的還原性，因此可以作為氫供體來還原自由基，因此黃酮類物質具有較強的清除DPPH和超氧自由基O2-·的能力，是一種很有潛力的抗氧化劑[16]。綜上可知，茶多酚和總黃酮的含量是影響茶葉抗氧化活性的重要因素，由表1可知A湄潭翠芽的茶多酚和總黃酮的含量在5種茶葉中含量最高，由圖1、2和3可知A湄潭翠芽的抗氧化活性最高，進一步驗證了結果的可靠性。

表3 抗氧化活性與抗氧化成分及顏色參數的相關性分析Table 3 Correlation coefficients between antioxidant activity and antioxidant components and color parameters

茶湯顏色中參數a*值與FRAP、DPPH呈顯著性相關（P＜0.05），與 ABTS呈極顯著性相關（P＜0.01），其它顏色參數 L*、b*、C*、H°與抗氧化活性之間相關性不顯著，這表明，茶葉顏色只能作為簡單初步評價茶葉抗氧化活性，不能作為評價標準。

2.5 主成分分析

對抗氧化活性（FRAP法、ABTS法、DPPH法）、抗氧化成分（茶多酚、總黃酮、沒食子酸、茶黃素、兒茶素）、顏色參數（L*、a*、b*、C*，H°）這 13 個變量進行主成分分析，結果見表4。

表4 主成分分析Table 4 Principal component analysis

結果表明前3個主成分可以解釋92.736%的變異（表4）。其中，第一個主成分（PC1）是最重要的，解釋62.315%的變異（表 5），ABTS、總黃酮、茶多酚、FRAP、及a*是對第一個主成分影響的主要特征向量，分別為0.939、0.926、0.912、0.900、0.900 （表 5）。第 2 主成分（PC2）解釋 19.525%的變異，沒食子酸、茶黃素、L*、b*、c*及DPPH是對第2個主成分影響的主要特征向量，分別為-0.839、-0.514、0.685、0.583、0.573、0.346（表5）。第3主成分（PC3）解釋10.896%的變異，主要來自于兒茶素（表5）。

表5 前3個主成分的變異來源Table 5 Source of variation for three principal components（PC）

圖4為5種茶葉在第1、2、3主成分散點分布圖。

從圖4中可以看出，A湄潭翠芽和C鳳岡鋅硒，都位于圖中PC1的正區(qū)域，主要和ABTS、總黃酮、茶多酚、FRAP等相關聯(lián)。從PC3分布來看，D貴定云霧處于正區(qū)域；A湄潭翠芽、B石阡苔茶、C鳳岡鋅硒和E都勻毛尖都處于負區(qū)域。A、B、C和E 4種在圖中相距較近，表明4種茶葉相關指標差異不大，而與D茶葉在圖上相距較遠，表明它們相關指標差異較大。

圖4 5種不同茶葉在第1、2、3主成分分布Fig.4 Scatter plot of the first two three principal component analysis of five types of tea

3 結論

使用3種評價體系比較貴州5種茶葉的抗氧性，通過試驗發(fā)現(xiàn)結果略有不同，其原因在于每種不同抗氧化評價體系之間存在一定的差異性。貴州5種茶葉的抗氧化活性、抗氧化性成分及顏色參數存在顯著性差異（P＜0.05）。通過對數據相關性分析處理，發(fā)現(xiàn)茶多酚與抗氧化性指標呈顯著正相關（P＜0.05），而抗氧性成分及顏色參數也與抗氧化性、茶多酚有一定的相關性。通過主成分分析表明，茶多酚含量、鐵還原氧化能力、ABTS+自由基清除活性、DPPH自由基清除活性等指標是評判茶葉抗氧化性的重要指標。貴州5種不同種類茶葉的抗氧化性及抗氧化成分的差別，為不同種類茶葉資料的利用提供了科學理論依據。