魯青，張超鳳，嚴(yán)美婷，張良

（江西省食品發(fā)酵研究所，江西宜春336000）

火龍果又名紅龍果、仙蜜果，典型的熱帶植物[1]，主要在我國(guó)海南、廣東、福建和廣西等地種植[2]?；瘕埞夂凸ぞ胸S富的紅色素[3]，紅色素的主要成分是甜菜苷類(lèi)甜菜紅素[4]，其安全無(wú)害，具有抗氧化作用[5]、抑制脂質(zhì)氧化[6]和抗腫瘤[7-8]等功效，可作為天然色素添加到食品中。然而在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，由于火龍果皮的不可食用性，因而在加工過(guò)程中將其作為廢物直接遺棄，浪費(fèi)資源且增加了環(huán)境的壓力。若從火龍果皮提取天然色素甜菜紅素，不僅原料豐富，增加了火龍果的附加值和企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)還可緩解環(huán)境壓力。

目前火龍果色素的提取多采用溶劑浸提法和超聲輔助溶劑浸提法，具有成本低、浸提溫度低和操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[9]。如周俊良等[10]采用的40%乙醇浸提30 min，提取率達(dá)7.36%；賀江等[11]采用的超聲輔助乙醇溶液浸提20 min，吸光度達(dá)0.505。纖維素酶因可提高待提取生物活性成分的提取率[12]的特點(diǎn)經(jīng)常被用于酶解提取植物活性成分。查找相關(guān)文獻(xiàn)還未發(fā)現(xiàn)利用纖維素酶酶解輔助提取火龍果中的色素。本試驗(yàn)以火龍果皮干粉為原料，超聲波-酶解輔助乙醇提取火龍果皮中的色素。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，確定最佳的提取工藝并測(cè)定該條件下提取制備的色素的色價(jià)，以期為火龍果皮中的色素的進(jìn)一步加工利用提供一定技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火龍果皮：市售；乙醇（AR）、磷酸氫二鈉（AR）：西隴科學(xué)股份有限公司；纖維素酶（10萬(wàn)U/g）：和氏璧生物科技有限公司；檸檬酸（AR）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋（HHS21-6）：江蘇金壇市瑞華儀器有限公司；天平（ML204）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；分光光度計(jì)（SP-756PC）：上海光譜儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBE）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高速臺(tái)式離心機(jī)（TGL-15B）：上海安亭科學(xué)儀器廠；超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（DWHL340）：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-10N）：寧波新芝微生物科技有限公司；溶劑過(guò)濾器（QL-01）：天津市旗美科技有限公司；直連旋片式真空泵（ZXZ）：浙江臨海市永昊真空設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色素的提取及其制備工藝

火龍果→清洗→皮肉分離→果皮切碎→40℃烘干→粉碎→過(guò)篩→提取劑浸提→離心（4 000 r/min，5 min）→收集上清液→真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→真空冷凍干燥→粉碎得火龍果色素粉末

1.3.2 操作要點(diǎn)

1）果皮切碎：新鮮果皮清洗后切成1 cm×1 cm的小塊，便于后續(xù)的干燥和粉碎。

2）烘干：切碎的果皮置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，于40℃烘干12 h。

3）過(guò)篩：粉碎后的果皮粉過(guò)40目篩，未能過(guò)篩的較大果皮顆粒二次粉碎后密封保存，備用。

4）浸提：為防止色素物質(zhì)發(fā)生光分解或光氧化，果皮粉按一定比例溶于提取劑中后，置于黑暗避光環(huán)境中浸提。

5）濃縮：上清液濃縮前，將上清液過(guò)0.22 μm水系濾膜，抽濾除去色素中的果膠，在40℃條件下，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，回收乙醇，殘?jiān)蒙倭康恼麴s水溶解得火龍果皮色素濃縮液，備用。

6）真空冷凍干燥：將火龍果皮色素濃縮液在-40℃條件下冷凍24 h，再將其置于提前預(yù)冷的真空冷凍干燥器中，干燥24 h。

1.3.3 火龍果皮色素提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

試驗(yàn)中酶解時(shí)間為20 min，浸提料液比為1∶40（g/mL），浸提溫度為40℃，pH值為7條件下浸提，每隔10 min攪拌一次，浸提完成后4 000 r/min離心5 min，取上清液待測(cè)。以纖維酶（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%）、乙醇的濃度（0、15%、30%、45%、60%、75%）、超聲功率（40、50、60、70、80、100 W）、提取時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）為考察因素，以甜菜紅素提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的提取工藝參數(shù)。

1.3.4 火龍果皮色素提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以甜菜紅素提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以纖維酶添加量、乙醇濃度、超聲功率和提取時(shí)間考察因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以確定最佳的發(fā)酵工藝，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

1.3.5 檢驗(yàn)方法

1.3.5.1 甜菜紅素含量的測(cè)定

利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定火龍果皮色素提取液在波長(zhǎng)536 nm的吸光度值，按照以下公式計(jì)算提取液中甜菜紅素的含量。

甜菜紅素的含量（T）=（OD536×550.11）/61 600

式中：OD536為火龍果皮色素提取液在波長(zhǎng)536 nm的吸光度值；550.11為標(biāo)準(zhǔn)甜菜紅素摩爾分子質(zhì)量，61 600為標(biāo)準(zhǔn)甜菜紅素摩爾消光系數(shù)。

1.3.5.2 甜菜紅素提取率的計(jì)算

甜菜紅素得率/%=[（T×V）/m]×100

式中：T為火龍果皮色素提取液中甜菜紅素的含量，g/mL；V為提取液的體積，mL；m為火龍果皮粉末的質(zhì)量，g。

1.3.5.3 色價(jià)的測(cè)定

色價(jià)是指單位質(zhì)量原料的提取物在1%濃度、以1 cm比色皿在其最大吸收峰處的吸光度。具體的測(cè)試方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果皮色素粉m，用pH=3.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解并定容，再用緩沖液稀釋到合適倍數(shù)（溶液的吸光度控制在0.2～0.6之間），在λ=536 nm及1 cm比色血中測(cè)定吸光度（A），則產(chǎn)品的色價(jià)為：

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶添加量對(duì)甜菜紅素提取率的影響

將干燥粉碎的火龍果皮粉末按照工藝流程進(jìn)行浸提提取，纖維素酶的添加量對(duì)甜菜紅素提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)甜菜紅素提取率的影響Fig.1 Effect of fibrinase addition on extraction rate of betaine

有研究報(bào)道纖維素酶增加色素的提取率，但果膠酶不具有這種功能[13]，為此試驗(yàn)中選用纖維素酶聯(lián)合超聲提取技術(shù)提取火龍果皮中的色素。由圖1可知，當(dāng)纖維酶添加量為0～0.2%時(shí)，隨著纖維素酶添加量的增加，甜菜紅素提取率隨之提高；當(dāng)纖維酶添加量為0.2%時(shí)，甜菜紅素提取率達(dá)到最高為37.22%；當(dāng)纖維酶添加量為0.2%～1%時(shí)，隨著纖維素酶添加量的增加，甜菜紅素提取率先下降后趨于平穩(wěn)，可能是因?yàn)榈孜餄舛扰c纖維素酶量相比過(guò)低，使得纖維素酶的效果受到抑制，從而甜菜紅素提取率有所降低[12]。為此纖維素酶最佳的添加量為0.2%。

2.2 乙醇的濃度對(duì)甜菜紅素提取率的影響

乙醇的濃度對(duì)甜菜紅素提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇的濃度對(duì)甜菜紅素提取率的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on extraction rate of betaine

由圖2可知，當(dāng)乙醇的濃度為0～30%時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，甜菜紅素提取率隨之提高；當(dāng)乙醇的濃度為30%時(shí)，甜菜紅素提取率達(dá)到最大為54.65%；當(dāng)乙醇的濃度為30%～75%時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，甜菜紅素提取率隨之下降，原因主要是由于火龍果皮中的甜菜紅色素為水溶性，有機(jī)濃度過(guò)高不利于火龍果皮中色素的提取，可能過(guò)高的乙醇濃度還會(huì)破壞色素結(jié)構(gòu)，這與高治平等[14]試驗(yàn)結(jié)果相一致。為此色素提取的最佳乙醇濃度為30%。

2.3 超聲功率對(duì)甜菜紅素提取率的影響

超聲功率對(duì)甜菜紅素提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲功率對(duì)甜菜紅素提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasound power on extraction rate of betaine

由圖3可知，當(dāng)超聲功率為40 W～50 W時(shí)，隨著超聲功率的增加，甜菜紅素提取率隨之提高；當(dāng)超聲功率為50 W時(shí)，甜菜紅素提取率達(dá)到最大為66.3%；當(dāng)超聲功率為50 W～100 W時(shí)，隨著超聲功率的增加，甜菜紅素提取率隨之下降后趨于平穩(wěn)，原因主要是由于超聲功率的增加會(huì)破壞色素結(jié)構(gòu)[15]。為此色素提取的最佳超聲功率為50 W。

2.4 提取時(shí)間對(duì)甜菜紅素提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)甜菜紅素提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)甜菜紅素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of betaine

由圖4可知，當(dāng)超聲時(shí)間為10min～20min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增加，甜菜紅素提取率隨之提高；當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，甜菜紅素提取率達(dá)到最大為70.1%；當(dāng)超聲時(shí)間為20 min～60 min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增加，甜菜紅素提取率隨之下降后趨于平穩(wěn)。為此色素提取的最佳超聲時(shí)間為20 min。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察纖維酶添加量、乙醇濃度、超聲功率和提取時(shí)間這4個(gè)因素對(duì)甜菜紅素提取率的影響，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，考慮飲料的適口性，以提取液中甜菜紅素提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 火龍果皮色素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extractingred pigment of pitaya peel

由表2可知，通過(guò)極差分析可知4個(gè)因素對(duì)甜菜紅素提取率的影響大小依次為D＞B＞C＞A，即提取時(shí)間對(duì)甜菜紅素提取率的影響最大，超聲功率次之纖維酶添加量影響最小，最佳的提取工藝為A1B2C3D2，在此工藝條件下甜菜紅素提取率為68.17%，與正交試驗(yàn)的第二組比較，低于第二組，為此確定甜菜紅素提取率最高的工藝為A1B2C2D2，即纖維酶添加量為1%、乙醇濃度為30%、超聲功率50 W和提取時(shí)間20 min，在此工藝條件下甜菜紅素提取率最高為70.15%。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在A1B2C2D2的工藝條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，甜菜紅素提取率分別為69.44%、70.01%、70.73%，均值為70.06%，與正交試驗(yàn)的結(jié)果接近，為此正交試驗(yàn)的結(jié)果可信。

2.7 火龍果皮色素粉末的制備及其色價(jià)的測(cè)定

在正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝條件下提取火龍果皮中色素，將上清液過(guò)0.22 um水系濾膜，抽濾除去色素中的果膠[16]。在40℃條件下，將除去果膠的上清液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘?jiān)蒙倭康恼麴s水溶解得火龍果皮色素濃縮液，在-40℃條件下冷凍24 h，再將其置于提前預(yù)冷的真空冷凍干燥器中，干燥24 h，取出粉碎得火龍果皮色素粉末，測(cè)定色價(jià)為2.071。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以火龍果皮為原料，經(jīng)鼓風(fēng)干燥粉碎過(guò)篩得火龍果皮粉末。利用超聲波-纖維素酶輔助提取火龍果色素。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳火龍果皮色素提取工藝條件為：纖維酶添加量為1%、乙醇濃度為30%、超聲功率50 W和提取時(shí)間20 min，在此條件下甜菜紅素提取率達(dá)70.06%，制備的火龍果皮色素粉末的色價(jià)為2.071。