李洪權，柏玉冰，謝文劍，劉曉紅，劉飛波，張瑞華，周熙，*

（1.株洲市食品藥品檢驗所，湖南株洲412000；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；3.安鄉(xiāng)縣中醫(yī)院，湖南常德415600；4.湖南省株洲炎帝生物責任有限公司，湖南株洲412000）

葛仙米（Nostoc sphaeroides Kützing）是藍藻門念珠藻科的一種低等單細胞藍藻，古名天仙菜、天仙米，俗稱水木耳[1]。據(jù)《綱目拾遺》記載，葛仙米“性寒，味甘爽”，具有“解熱，清膈，利腸胃”的功效[2]?，F(xiàn)代關于葛仙米的研究包括基礎物質[3-4]、藥理活性[5-8]以及提取工藝[9-12]。通過對這些研究報道分析，葛仙米多糖以其含量最高、活性最強及研究報道最為詳盡為葛仙米中最重要的成分。而對葛仙米多糖的研究，提取為初始步驟，尤為重要。目前關于葛仙米多糖的提取研究，主要包括單因素、正交等[10]，而尚未發(fā)現(xiàn)響應面法提取葛仙米中多糖的工藝研究。

對于多糖的定量方式有多種，如比色法、滴定法、高效液相色譜法、氣相色譜法等，其中對多糖水解后的單糖衍生物用高效液相色譜進行測定的方法簡單、快速、重復性好[13]。因此，本研究特選此方法并基于響應面法優(yōu)化葛仙米多糖的浸提工藝，為后續(xù)葛仙米及其多糖的進一步研究奠定基礎。

1 材料與儀器

葛仙米：湖南炎帝生物科技有限公司；葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖：中國食品藥品檢定研究院。

三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、95%乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

水浴鍋（HWS24）：上海一恒科學儀器有限公司；離心機（ST16R）：賽默飛世爾科技公司；旋轉蒸發(fā)儀（RE-2000B）：上海亞榮生化儀器廠；高效液相色譜儀（Uitimate 3000）：賽默飛世爾科技公司；電子天平（XSE 205DV）：梅特勒-托利多國際貿易有限公司；超聲儀（HNS-SY-150）：北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜方法的建立

色譜柱：Welch Xtimate（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長：260 nm，柱溫：30℃，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL，流動相：以 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（用3 mol/L氫氧化鈉調節(jié)pH值至6.7）為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫，流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 樣品、標準品的制備和標準曲線的建立

2.2.1 標準溶液的制備及標準曲線的建立

分別精密稱取甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖及巖藻糖標準品100mg于10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得9種單糖的標準儲備溶液。再配置成濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 的不同濃度梯度單糖混合標準溶液。分別取100 μL的單糖標準液及不同濃度梯度的混合標準溶液，各加200 μL、0.6 mol/L的NaOH溶液，置于10 mL的具塞試管中，漩渦混勻；再加400 μL、0.6 mol/L的PMP甲醇溶液，漩渦混勻，充入N2，在70℃的烘箱中避光反應110 min，取出避光冷卻至室溫，加400μL、0.3mol/L的HCl溶液中和，加水至2 mL，再加等體積的氯仿，漩渦混勻，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0.45 μm微孔膜過濾后供高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析，得混標如圖1所示，并經軟件計處理得標準曲線如表2所示。

圖1 混合標準品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of mirture standards

表2 被測成分的線性關系、線性范圍和相關系數(shù)Table 2 Linear equation，linear range and correlation of studied components

2.2.2 樣品的制備

提取：取經60℃干燥至恒重的葛仙米，粉碎過4號篩后，取粉末約0.5 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中。加水以一定料液比，置于70℃水浴鍋中復水30 min后，水浴鍋調至單因素考察所需溫度，浸提考察所需時間見表3，適當攪拌數(shù)次，浸提3次，合并浸提液。浸提液轉移至2 L圓底燒瓶中，70℃旋蒸濃縮至約50 mL。濃縮液轉移至500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL、95%乙醇，適當振搖，靜置醇沉 12 h，離心，棄去上層殘液，殘渣經真空干燥至恒重，備用。

表3 浸提考察條件Table 3 The inspection condition of extraction

溶解：精密稱取約0.15 g葛仙米浸提物于50 mL離心管中，加水20 mL，置于熱水浴中至浸提物完全溶解。

水解：取1 mL溶解液于10 mL具塞試管中，加入400 μL濃度為4 mol/L 三氟乙酸（TFA），充入 N2封管，在110℃烘箱中水解4 h，冷卻后，加2次2 mL甲醇，用N2吹干，重復兩次，去除TFA，精密加入0.1 mL水溶解，得水解樣品，待衍生。

衍生：同2.2.1。

2.2.3 含量計算

單糖總量Y總=Y1+Y2+Y3+Y4+Y5+Y6，單糖總量得率/%=Y總/葛仙米稱樣量×100。

2.3 單因素考察

2.3.1 料液比對提取率的影響

取0.5g葛仙米粉末，精密稱定，固定超聲時間1.5h，溫度為 100℃，分別以料液比 1∶100、1∶150、1∶200、1 ∶250、1 ∶300（g/mL）條件下按上述“2.2.2 樣品前處理”、“2.1色譜方法”以及“2.2.3含量計算”分析處理。料液比影響結果見圖2。

圖2 料液比對提取率的影響Fig.2 Effect of material/water ratio on the extraction efficiency

由圖2可以看出在其他條件一定時，料液比為1∶100（g/mL）～1 ∶200（g/mL）對單糖總量得率影響顯著，隨著水的增大，單糖總量得率明顯增加；當水超過200時，單糖總量得率隨著水的增加變化很小。因此，料液比的選擇，如果水的比值偏小，多糖浸提不徹底，水解衍生后單糖總量得率低；如果水比值偏大，對多糖的浸出沒有較大增加，單糖總量也不增加，反而使后續(xù)工作費時費力費料。

2.3.2 時間對提取率的影響

取0.5 g葛仙米粉末，精密稱定，固定料液比1∶200（g/mL），溫度為 100℃分別以時間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h條件下按上述“2.2.2樣品前處理”、“2.1色譜方法”以及“2.2.3含量計算”分析處理。時間影響結果見圖3。

圖3 浸提時間對提取率的影響Fig.3 Effect of extracting time on the extraction efficiency

由圖3可知，在其他條件一定時，浸提時間0.5 h～1.5 h對單糖總量得率影響很大，隨浸提時間延長，得率明顯增加；浸提時間1.5 h～2.5 h的多糖得率隨浸提時間增加而無明顯變化。

2.3.3 溫度對提取率的影響

取0.5 g葛仙米粉末，精密稱定，固定超聲時間1.5 h，料液比 1 ∶200（g/mL），分別以溫度為 80、85、90、95、100℃條件下按上述“2.2.2樣品前處理”、“2.1色譜方法”以及“2.2.3含量計算”分析處理。溫度影響結果見圖4。

圖4 溫度對提取率的影響Fig.4 Effect of extracting temperature on the extraction efficiency

由圖4可知，在其他條件一定時，單糖總量得率隨著浸提溫度的升高，85℃～95℃急劇增加，95℃～100℃略微增加。

2.4 響應面試驗

本試驗根據(jù)Design Expert 8.0軟件中的Box-Behnken試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選取對葛仙米單糖總量得率影響顯著的料液比（A）、浸提時間（B）和浸提溫度（C）為考察因素，用-1、0、1來表示低、中、高3個水平，以單糖總量得率（Y）為響應值，因素水平表見表4，響應面結果見表5。

表4 響應面試驗設計因素與水平Table 4 Factors and levels used in response surface design

表5 響應面試驗方案及結果Table 5 Response surface design arrangement and experimental results

續(xù)表5 響應面試驗方案及結果Continue table 5 Response surface design arrangement andexperimental results

利用Design Expert 8.0程序軟件對表5中的試驗結果進行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到多糖得率對水料比（A）、浸提時間（B）、浸提溫度（C）的三元二次回歸方程：Y=28.81+2.53A+2.36B+2.50C+0.77AB-0.12AC+0.11BC-2.50A2-2.52B2-3.76C2，方差分析見表6。

表6 擬合二次多項式模型的方差分析Table 6 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

從表6可看出，一次項中，A（料液比）和C（溫度）對單糖總量得率的線性效應高度顯著，B（時間）對多糖含量的線性效應極顯著，二次項中，A2、B2影響均極顯著，C2影響高度顯著，AB、AC、BC的交互影響不顯著。此模型顯著性檢測P值為0.000 4，高度顯著，失擬項P值為0.081 1，不顯著，校正模型的相關系數(shù)R2值為0.961 2，決定系數(shù)R2Adj值為0.911 3，說明選用的模型與實際情況擬合較好、誤差小，能較好反應出各因素與葛仙米多糖水解后單糖總量之間的關系。且由F值可知，在試驗范圍內各因素對多糖含量的影響大小依次為料液比＞浸提溫度＞浸提時間。兩因素交互作用對提取率影響的響應面圖見圖5～圖7。

圖5 浸提時間與料液比交互效應曲面圖Fig.5 Mutual domino effect bent surface mapping of extraction time and solid-liquid ratio

圖6 浸提溫度與料液比交互效應曲面圖Fig.6 Mutual domino effect bent surface mapping of extraction temperature and liquid-solid ratio

圖7 浸提溫度與浸提時間的交互效應曲面圖Fig.7 Mutual domino effect bent surface mapping of extraction temperature and time

由圖5～圖7可知，浸提時間、浸提溫度和料液比對葛仙米單糖總量都有顯著的影響。其中，料液比影響最為顯著，圖中曲面陡峭，隨著水的增加，單糖總量增加；浸提溫度的影響相對顯著，曲面較為陡峭；浸提時間影響次之。

葛仙米多糖適宜的提取工藝參數(shù)為浸提時間1.78 h、浸提溫度 96.66℃、料液比 1∶229.32（g/mL）。在此條件下，模型預測葛仙米單糖總量為30.64%?？紤]到實際應用過程中操作簡便，將工藝條件修正為浸提時間 110 min，浸提溫度 97 ℃，料液比 1 ∶230（g/mL）；在此條件下，得到單糖總量得率為29.14%。已有相關報道中，莫開菊等[10]用熱水浴提取并進行正交試驗得出最佳條件為 90℃，提取 6 h，料液比為 1 ∶90（g/mL），提取4次，提取率為14.09%。其最佳條件和多糖得率均與本試驗有較大差異。最為顯著的差異為液料比和提取時間，此差異可能主要源于與本試驗設計方式和含量考察指標的不同。但是本試驗提取次數(shù)更少、提取時間更短。

3 結論

最終，通過回歸模型分析，以多糖水解后單糖總量得率為評價指標，葛仙米多糖適宜的提取工藝參數(shù)為浸提時間110 min、浸提溫度97℃、料液比1∶230（g/mL）；在此條件下，得到單糖總量得率為29.14%，實際值與理論值基本相符，說明模型對葛仙米多糖提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠可行，具有一定的實用價值。